El compuesto 18- (ftalimida-2-il)-ferruginol afecta la traducción de proteínas virales y la remodelación de actina durante la infección in vitro por el virus dengue

Abstract

RESUMEN: La infección por el virus dengue es la arbovirosis más importante del mundo. Sin embargo, no se han aprobado medicamentos antivirales para su tratamiento. Como un nuevo enfoque de investigación antiviral, los denominados antivirales dirigidos al hospedero (HTA, por sus siglas en inglés) aparecen como una estrategia prometedora, principalmente por su alta barrera genética y su baja probabilidad de seleccionar cepas virales resistentes a los medicamentos. Utilizando ensayos de unidades formadoras de placa, acoplamiento molecular, microscopía de fluorescencia cuantitativa y análisis de imágenes, encontramos que el compuesto18-(ftalimida-2-il)-ferruginol, un análogo semi-sintético del ferruginol, se acopla con alta afinidad a la GTPasa RhoA (-9.8 kcal/mol) y a la proteína NS5 de DENV-2 (-9.6 kcal/mol). Además, esta molécula reduce drásticamente la formación de filamentos de actina e induce cambios en la morfología celular cuando se agrega a los cultivos celulares antes o después de la infección por DENV-2, pero no tiene efecto sobre los microtúbulos o filamentos intermedios. La activación de RhoA en células infectadas se vio afectada cuando el compuesto se adicionó después de 6 h.p.i. Asimismo, esta molécula disminuye la intensidad de fluorescencia de la proteína de la envoltura viral, la proteína NS3 y el dsRNA, generando alteraciones en el patrón de distribución de estos componentes virales, así como la reducción del rendimiento del virus, especialmente cuando se adicionó después de 6 y 12 h.p.i. Los ensayos de Western blot y RT-qPCR revelan que este análogo disminuye la traducción de la poliproteína viral cuando se utilizó una línea celular que expresa establemente un replicón de DENV-2 y el virus recombinante, RLuc-tagged DENV-2. El tratamiento antes y en las primeras etapas de la infección no afecta la adhesión y/o entrada viral. Por otra parte, los experimentos de citometría de flujo y wound-healing sugieren que los efectos celulares provocados por este compuesto no se relacionan con eventos apoptóticos tempranos y que podrían ser reversibles. En general, estos hallazgos sugieren que el compuesto 18-(ftalimida-2-il)-ferruginol tiene un mecanismo de acción relacionado con HTA, posiblemente interrumpiendo la traducción de la poliproteína de DENV-2 a través de la alteración de la remodelación de actina y alterando otros procesos celulares y virales relacionados con la formación de los complejos replicativos.

ABSTRACT: Dengue virus infection is the most important arbovirosis around the world. However, no antivirals drugs have been approved for its treatment. As a new antiviral research approach, the named Host-Targeted Antivirals (HTA) appears as a promising strategy, mainly by its high barrier to resistance and low probability to select drug-resistant viral strains. Using plaque-forming units assays, molecular docking, fluorescence microscopy and image analysis, we found that the 18-(phthalimide-2-yl)-ferruginol, a semi-synthetic ferruginol analogue, couples with high affinity to RhoA GTPase (-9.8 kcal/mol) and to DENV-2 NS5 protein (-9.6 kcal/mol). Also, this molecule dramatically reduces actin filament formation and induces cellular morphological changes when it was added to cell cultures prior to or after DENV-2 infection but has no effect on microtubules or intermediate filaments. RhoA activation in infected cells was affected when the compound was added after 6 h.p.i. Further, this molecule decreases the fluorescence intensity of viral envelope protein, NS3 protein and dsRNA, with alterations in the distribution pattern of these viral components, as well as reducing the yield of the virus, especially when it was added after 6 and 12 h.p.i. Western blot and RT-qPCR assays reveal that this analog decreases viral protein translation when a DENV-2 replicon stable cell line and recombinant RLuc-tagged DENV-2 were used. Treatment before and in the early stages of infection does not affect viral attachment and/or entry. Additionally, flow cytometry and wound-healing experiments hint that cellular effects prompted for this compound do not relate to early apoptotic events and it could be reversible. Overall, our findings strongly suggest that 18-(phthalimide-2-yl)-ferruginol has an HTA-related mechanism of action, possibly disrupting the polyprotein translation of DENV-2 via alteration of actin remodeling and other related cellular and viral processes involved on replicative complexes formation.