Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: https://hdl.handle.net/10495/29377
Título : Efecto de toxinas provenientes de P. verdolaga sobre corrientes de Ca2+ y K+ en células excitables de un modelo murino
Autor : Gómez Restrepo, Alejandro
metadata.dc.contributor.advisor: Álvarez Bustamante, Alexander
Manrique Moreno, Marcela María
Segura Latorre, César Hernando
metadata.dc.subject.*: Péptidos
Peptides
Venenos de araña
Spider venoms
Canales iónicos
Ion channels
Miocitos cardíacos
Myocytes, cardiac
Modelos animales
Models, animal
Ganglios espinales
Ganglia, spinal
Modelo murino
Tarántula: Pamphobeteus verdolaga
https://id.nlm.nih.gov/mesh/D010455
https://id.nlm.nih.gov/mesh/D013111
https://id.nlm.nih.gov/mesh/D007473
https://id.nlm.nih.gov/mesh/D032383
https://id.nlm.nih.gov/mesh/D023421
https://id.nlm.nih.gov/mesh/D005727
Fecha de publicación : 2022
Resumen : RESUMEN: Introducción: Los venenos producidos por animales son mezclas complejas de proteínas, péptidos, carbohidratos y otras biomoléculas, que en conjunto alteran procesos fisiológicos y bioquímicos sobre el individuo inoculado. Las toxinas, usualmente péptidos de bajo peso molecular, son los componentes activos del veneno. Éstas han sido herramientas de investigación invaluables que han servido para explicar diversos procesos fisiológicos como la coagulación o las propiedades eléctricas de células excitables. Muchas toxinas provenientes de arañas son péptidos de menos de 10 kDa con puentes disulfuro (DBP, por sus siglas en inglés “disulfide bridged peptides”). Los DBP tienen alta resistencia a proteasas, pH ácido y altas temperaturas y gran afinidad por canales como: TRP (transient receptor potential channel), ASIC (acid-sensing ionic channel), receptores de glutamato, y canales iónicos dependientes de voltaje. Análisis bioinformáticos del transcriptoma de la glándula venenosa de la araña Pamphobeteus verdolaga han mostrado la presencia de DBP, para los cuales no se ha establecido su potencial efecto sobre corrientes iónicas de Ca2+ (ICa) y K+ (IK) en células excitables. Objetivo general: Evaluar el efecto de DBP provenientes del transcriptoma de la glándula venenosa de la araña P. verdolaga sobre ICa e IK en células excitables de un modelo murino. Metodología: Se estandarizó el aislamiento de cardiomiocitos y neuronas del ganglio espinal (DRG) por medio del sistema de perfusión inversa de Langendorff y métodos enzimáticos (colagenasa y proteasa), de ratones adultos, machos, de la cepa Swiss Webster. El aislamiento exitoso de los cardiomiocitos se comprobó mediante la determinación de las características morfológicas y la respuesta a estímulos eléctricos. La obtención de neuronas del DRG fue validada por medio de inmunofluorescencia indirecta con los marcadores del citoesqueleto neuronal NF-200 y β-lll-tubulina, la viabilidad celular fue comprobada usando el indicador fluorescente de Ca2+ Mag-Fluo-4. Las imágenes de campo claro y fluorescencia se adquirieron mediante una cámara acoplada a un microscopio invertido, equipado con los filtros adecuados. Se evaluó el efecto de 5 DBP y 1 péptido sin puentes disulfuro (NDBP) sobre ICa e IK en cardiomiocitos mediante la técnica de patch-clamp, en configuración whole cell, a partir de sellos de alta resistencia (>1x109 Ω). Las pipetas se fabricaron puliendo capilares de borosilicato hasta obtener resistencias en el baño entre 1.6-2.6 MΩ y se utilizaron soluciones internas y externas específicas para aislar las corrientes de interés. Los péptidos fueron suministrados por un grupo colaborador. Para todos los experimentos se hicieron entre 3 y 6 réplicas independientes. Resultados: De cada corazón se obtuvieron abundantes cardiomiocitos intactos, con membrana brillante, forma alargada, extremos irregulares, estriaciones transversales, contracción ante el estímulo y presencia de corrientes iónicas. Las neuronas del DRG fueron positivas para los marcadores NF-200 y β-lll-tubulina, y se cargaron con el indicador fluorescente Mag-Fluo-4, demostrando una intensidad y homogeneidad de fluorescencia esperables para células vivas. Se obtuvieron de manera exitosa corrientes iónicas de Ca2+ tipo L (ICaL) e IK, con cinéticas y curvas corriente-voltaje similares a las descritas en la literatura. Se logró evaluar el efecto de los 6 péptidos de interés sobre ICaL e IK en cardiomiocitos de ratón. Los péptidos vrdg69 y vrdg177 poseen un efecto inhibitorio mayor al 40% tanto sobre ICaL como IK, lo cual los hace péptidos poco selectivos. vrdg183 mostró un efecto inhibitorio mayor al 66% sobre ICaL, pero despreciable sobre IK. vrdg164 tuvo un efecto inhibitorio menor al 25% sobre ICaL e IK, pero retrasó el tiempo de activación de ICaL. Esto puede indicar que el péptido interacciona con el dominio sensor de voltaje. vrdg66, el único NDBP, inhibió 16% ICaL y 24% IK. Discusión y conclusiones: La caracterización de los modelos celulares basada en técnicas morfológicas, moleculares, y electrofisiológicas, así como la cinética de las corrientes obtenidas, permiten asegurar que los resultados son confiables. vrdg183 y vrdg164 muestran resultados promisorios por su efecto específico sobre ICaL. Esto podría darles potencial uso como antihipertensivos, herramientas biotecnológicas o moduladores de canales para investigación. De otro lado, los péptidos que no mostraron efecto sobre canales exhibieron potencial actividad antimicrobiana. Nuestros resultados sugieren que pueden ser cardioseguros, permitiéndoles continuar su desarrollo como potenciales medicamentos. El mecanismo más probable para explicar la inhibición de las corrientes es la interacción directa del péptido con el canal, algo que debe verificarse en futuros ensayos utilizando otras técnicas de estudio. Este trabajo de grado se convierte en el primero de un estudiante de la CCBB utilizando técnicas de electrofisiología celular dentro de la Universidad de Antioquia (UdeA). Se abre la puerta para futuros proyectos, publicaciones y colaboraciones entre Grupos de investigación en Ciencias Biomédicas. Proyecto 111577757673, Minciencias.
ABSTRACT: Introduction: Animal venoms are complex mixtures of proteins, peptides, carbohydrates and other biomolecules, which together alter physiological and biochemical processes on the inoculated individual. Toxins, usually low molecular weight peptides, are the active components of the venoms. Toxins have been invaluable research tools that have helped to explain various physiological processes such as coagulation or the electrical properties of excitable cells. Many spider toxins are disulfide bridged peptides (DBP) of less than 10 kDa. DBP have high resistance to proteases, acid pH and high temperatures, as well as great affinity for channels such as: TRP (transient receptor potential channels), ASIC (acid-sensing ionic channels), glutamate receptors, and voltage-dependent ion channels. Bioinformatic analyzes of the transcriptome of the venom gland of the spider Pamphobeteus verdolaga have shown the presence of DBP, for which its potential effect on ionic currents of Ca2+ (ICa) and K+ (IK) in excitable cells has not been studied. General objective: To evaluate the effect of DBP from the transcriptome of the venom gland of the spider P. verdolaga on ICa and IK in excitable cells of a murine model. Methodology: The isolation of cardiomyocytes and neurons of the dorsal root ganglion (DRG) was standardized by means of the Langendorff inverse perfusion system and enzymatic methods (collagenase and protease), from adult male mice of the Swiss Webster strain. The successful isolation of cardiomyocytes was verified by determining the morphological characteristics and the response to electrical stimuli. DRG neurons were validated by means of indirect immunofluorescence with the markers of the neuronal cytoskeleton NF-200 and β-lll-tubulin. Cell viability was verified using the fluorescent indicator of Ca2+ Mag-Fluo-4. Brightfield and fluorescence images were acquired using a camera attached to an inverted microscope, equipped with the appropriate filters. The effect of 5 DBP and 1 peptide without disulfide bridges (NDBP) on ICa and IK in cardiomyocytes was evaluated using the patch-clamp technique, in whole cell configuration, from high-resistance seals (>1x109 Ω). Micropipettes were fabricated by polishing borosilicate capillaries to bath resistances between 1.6-2.6 MΩ and specific internal and external solutions were used to isolate the currents of interest. Peptides were supplied by a collaborating research group. For all experiments, between 3 and 6 independent replicates were made. Results: Abundant intact cardiomyocytes were obtained from each heart, with a shiny membrane, elongated shape, irregular ends, transverse striations, contraction to the electrical stimulus and the presence of ionic currents. Neurons from the DRG were positive for the NF-200 and β-lll-tubulin markers. When loaded with the fluorescent indicator Mag-Fluo-4, showed an intensity and homogeneity of fluorescence expected for living cells. Type L Ca2+ ionic currents (ICaL) and IK were successfully obtained, with kinetics and current-voltage curves like those described in the literature. It was possible to evaluate the effect of the 6 peptides of interest on ICaL and IK in mouse cardiomyocytes. Peptides vrdg69 and vrdg177 had an inhibitory effect greater than 40% on both ICaL and IK, which makes them less selective peptides. vrdg183 showed an inhibitory effect greater than 66% on ICaL, but negligible on IK. vrdg164 had less than 25% inhibitory effect on ICaL and IK, but delayed ICaL activation time. This may indicate that the peptide interacts with the voltage sensing domain. vrdg66, the only NDBP, inhibited 16% ICaL and 24% IK. Discussion and conclusions: The characterization of cell models based on morphological, molecular, and electrophysiological techniques, as well as the kinetics of the currents obtained, sugest that the results are reliable. vrdg183 and vrdg164 show promising results due to their specific effect on ICaL. This could give them potential use as antihypertensives, biotechnological tools or ion channel modulators. On the other hand, the peptides that showed no effect on channels exhibited potential antimicrobial activity. Our results suggest that they may be safe to heart, allowing them to continue their development as potential drugs. The most probable mechanism to explain the inhibition of the currents is the direct interaction of the peptide with the channel, something that must be verified in future tests using other study techniques. 111577757673, Minciencias.
Aparece en las colecciones: Maestrías de la Corporación Académica Ciencias Básicas Biomédicas

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