Evaluación de la sincronización del ciclo celular de cultivos primarios de fibroblastos para la obtención de clones embrionarios bovinos por la técnica de clonación manual (CM)

Abstract

RESUMEN :La clonación es una valiosa herramienta para la obtención de animales de alto valor genético y/o fenotípico, animales en vía de extinción y transgénicos, además permite el estudio de los procesos biológicos que ocurren en el desarrollo embrionario temprano. Sin embargo, hasta la fecha la eficiencia de esta técnica es relativamente baja; trabajos que busquen entender y mejorar los porcentajes de embriones y nacidos vivos son valiosos para enriquecer esta tecnología. En el proceso de clonación por transferencia nuclear, el tipo, el origen y la condición en la que se encuentre la célula donante del núcleo es uno de los factores que más afecta el éxito de esta técnica. Es necesario que exista una sincronía y compatibilidad espacial y temporal entre el citoplasma del oocito receptor y el núcleo de la célula donante; así, la reprogramación nuclear y el desarrollo embrionario temprano podrán iniciarse y culminarse de la manera adecuada. En la transferencia nuclear, la etapa ideal del ciclo celular en la que debe estar la célula donante es G0/G1, cuando se utilizan oocitos receptores no activados en metafase II (MII). Para ello se utilizan diversos métodos de sincronización entre los que se destacan la restricción de suero y la alta confluencia en el cultivo celular. Hasta el momento en el medio científico no se ha llegado a un consenso general de cuál de ellos presenta los resultados más favorables. Es por esto que en este trabajo se planteó realizar una estandarización y caracterización del cultivo de fibroblastos bovinos a partir de explantes obtenidos por biopsia de oreja, y se compararon tres métodos de sincronización del ciclo celular (restricción de suero, alta confluencia celular y la combinación de ambos) por 24, 48 o 72 horas en cultivo.

ABSTRACT: Cloning is a valuable tool for the production of animals of high genetic and phenotypic value, endangered species and transgenic animals. Additionally, it allows the study of biological process that occurs in the early embryo development. However, until the date, the efficiency of the technique remains low. Therefore the importance to continue studies that allow to understand and improve the percentage of embryos and life births. During the cloning process by nuclear transfer, the type, origin and condition of the nuclear donor cell is one of the factors that affects the success of this technique. Temporal and spatial synchrony between the receptor oocyte cytoplasm and the nucleus of the donor cell is imperative for the nuclear reprogramming and the early embryo development to occur successfully. During nuclear transfer, the ideal cellular cycle stage of the donor cell is G0/G1 when using receptor oocytes not activated in MII. Different methods of synchronization can be used, including serum starvation and high confluence of cell culture. To date, there is no consensus concerning the most favorable synchronization method. In this study we performed a characterization and standardization of bovine fibroblast culture from ear biopsy and we compared three methods of cellular cycle synchronization (serum starvation, high confluence and the combination) during 24, 48 or 72 hours of cell culture. The fibroblasts were used as nuclei donors for the evaluation of the potential in vitro development and quality of embryos produced by manual cloning method (MC) and compared all the results with the results of embryos produced by in vitro fertilization and parthenogenesis.