Caracterización del perfil enzimático en una fermentación de cacao no convencional

Abstract

RESUMEN: La fermentación tradicional en las semillas de cacao se lleva a cabo mediante una sucesión microbiana, que involucra principalmente géneros de levaduras, bacterias acido lácticas y ácido acéticas. Estos microorganismos, metabolizan los nutrientes del mucílago transformándolos principalmente en ácidos orgánicos y alcoholes que penetran las semillas y favorecen procesos hidrolíticos sobre los principales componentes del grano. En este proceso fermentativo participa una maquinaria enzimática que cataliza algunas reacciones importantes para el desarrollo de sabores y aromas característicos del chocolate. Sin embargo, son pocos los reportes científicos acerca de la actividad enzimática endógena. La catálisis enzimática que acompaña la fermentación en el grano de cacao es aún objeto de estudio, aunque es esencial para el adecuado y óptimo desarrollo de su perfil organoléptico. En el presente trabajo se buscó analizar la actividad de enzimas hidrolíticas al interior del grano de cacao, durante un proceso de fermentación no convencional in vitro. Para este propósito, el trabajo se realizó en 3 etapas: en primer lugar, se desarrolló un protocolo de fermentación in vitro no convencional (o fermentación mixta) con el fin de obtener cacao fermentado bajo condiciones controladas a nivel de laboratorio. Dicho protocolo incluyó una fase de fermentación primaria con microorganismos y una fase de fermentación secundaria con extracto de frutas. En una segunda fase, se evaluó la actividad de las enzimas invertasa, polifenol oxidasa, proteasa y lipasa. En la fase final, se estableció un protocolo de extracción de ARN para semillas de cacao frescas y fermentadas a diferentes tiempos, con el fin de evaluar la expresión relativa de genes relacionados con la actividad enzimática monitoreada en la fase previa al interior de los granos de cacao durante la fermentación. Para el desarrollo del protocolo de fermentación no convencional, se estudiaron las variables tiempo de fermentación, tipo de extracto, relación masa/extracto fermentado y la proporción del inóculo iniciador conformado por microorganismos clave en el proceso como Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus farraginis y Acetobacter pasteurianus. En la fase dos del proyecto se estandarizaron previamente todos los métodos de determinación de la actividad enzimática invertasa, polifenol oxidasa, proteasa y lipasa, los cuales permitieron conocer el perfil de actividad enzimática de una fermentación control y la fermentación no convencional. En la fase tres, además de la estandarización del método de extracción de ARN a partir de granos de cacao fermentado, se determinó la expresión relativa de genes que codifican para las enzimas invertasa, polifenol oxidasa y las proteasas carboxipeptidasa y endoproteasa aspártica en algunos puntos de la fermentación, preseleccionados acorde a los resultados hallados en la fase anterior. Este trabajo, permitió desarrollar una metodología apropiada para la incorporación de características de sabor y aroma diferenciales en el cacao bajo condiciones in vitro, así como estimar su efecto sobre el perfil de enzimas relacionadas en el desarrollo de estos aromas y sabores o los propios del cacao fermentado.