Estandarización de una técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para detección de Herpesvirus bovino-1 en semen

Abstract

ABSTRACT: BHV-1 can be found in semen from seropositive animals, but the frequency of excretion and the impact of this route for the dissemination of the infection have not been established. In order to improve the sensibility of detection of the virus in semen, we attempted to standardize a PCR. As previously reported by others investigators we found that semen contains PCR inhibitory factors that makes it necessary to dilute the samples up to 1:6000 or more to obtain DNA amplification. With the purpose of increasing the sensibility of the assay, the amplified PCR product was detected by southern blot with an oligonucleotide probe internal to the amplified fragment, Preliminary assays showed a 100 fold increase in the sensibility with this strategy. Despite the high dilution of the semen sample, we could detected the virus in samples collected from bulls from herds with symptoms compatible with Infectious Bovine Rinotracheitis (IBR). This PCR could be used in quality control of specimens used in programs of artificial insemination and embryo transfer. In addition, it could be of used for the determination of the biological implications of this route of virological excretion.

RESUMEN: El HVB-1 puede extraerse en semen de animales seropositivos pero la frecuencia de excreción y el impacto de esta vi de transmisión no han sido aclaradas. Para contribuir a esta discusión se hizo un esfuerzo por estandarizar una prueba de PCR para HVB-1 en semen. Como otros autores lo habían informado, encontramos que el semen contiene factores inhibidores de la reacción que hacen que, cuando no se trabaja con DNA purificado, sea necesaria la dilución de la muestra hasta 1:6000 para poder lograr la amplificación del DNA viral. Con el objetivo de amentar la posibilidad de detección de la banda de DNA viral esperada, se utilizó un Southern Blot con una sonda obtenida a partir del poli nucleótido amplificado por los cebadores respectivos, marcada con P32. Los ensayos preliminares muestran un nivel de detección 100 veces mayor. A pesar de la alta dilución de la muestra de semen que reduce notoriamente la posibilidad de detección del PCR, esta prueba permitió la detección del virus en muestras de campo procedentes de un brote de enfermedad compatible con RIB. La prueba de PCR para la detección del HVB-1 en semen podría tener su mayor impacto en el control de calidad de programas de congelación de semen, inseminación artificial y transferencia de embriones; adicionalmente podría ser de utilidad para definir el verdadero impacto de esta vía de transmisión