273Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Ontogenia de los esporangios, formación y citoquímica de esporas en licopodios (Lycopodiaceae) colombianos Edgar Javier Rincón Baron1, 2, Cristina Hilda Rolleri3, Fernando Alzate Guarin1 & Jacinta Mireya Dorado Gálvez4 1. Grupo de Estudios Botánicos y Docentes del Instituto de Biología, Universidad de Antioquia, calle 67 No. 53 -108, Medellín, Colombia; ejrbaron@gmail.com, alzatef@gmail.com 2. Grupo Ecología y Diversidad Vegetal, Departamento de Biología, Calle 13 Nº 100-00, Universidad del Valle, Sede Meléndez, Cali, Colombia. 3. Laboratorio de Estudios de Anatomía Vegetal Evolutiva y Sistemática (LEAVES), Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 64 Nº 3 e/119 y 120 La Plata B1904 DZB, Buenos Aires, Argentina; tinar.cris@gmail.com 4. Departamento de Biología. Carrera 2 Nº 1A-25, Urbanización Caldas, Universidad del Cauca, Popayán, Colombia; jacintadorado@gmail.com Recibido 14-V-2013. Corregido 20-IX-2013. Aceptado 24-X-2013. Abstract: Ontogeny of the sporangium, spore formation and cytochemistry in Colombian Lycopodials (Lycopodiaceae). Studies on reproductive aspects of Lycopodiaceae are not very abundant in the scientific lit- erature, and constitute essential information to support taxonomic and systematic relationships among the group. Here we present a detailed study of the ontogeny of sporangia and sporogenesis, and the chemical determination of several compounds generated during spore formation. The analyses were performed in 14 taxa of six genera of the family, Diphasiastrum, Diphasium, Huperzia (a genus which is treated here including Phlegmariurus), Lycopodiella, Lycopodium and Palhinhaea. Specimens were collected in three departments from the Colombian Andes between 1 454-3 677m altitude. Ontogeny was studied in small, 1cm long pieces of strobili and axis, which were fixed in glutaraldehyde or FAA, dehydrated in alcohol, embedded in LR White, sectioned in 0.2- 0.5μm and stained with toluidine blue (TBO), a metachromatic dye that allows to detect both sporopollenin and lignin or its precursors, during these processes. For other studies, paraplast plus-embedded sections (3-5μm) were stained with safranin-fast green and alcian blue-hematoxylin. Chemical tests were also conducted in sec- tions of fresh sporangia at different stages of maturity using alcian blue (mucopolysaccharides), Lugol solution (starch), Sudan III (lipids), phloroglucinol (lignin) and orcein (chromosomes). Sections were observed with photonic microscope equipped with differential interference contrast (DIC) and fluorescence microscopy (for spore and sporangium walls unstained). Strobili and sporangia were dehydrated with 2.2 dimethoxypropane, critical point dried and coated with gold for scanning electron microscopy (SEM). Our results indicated that the ontogeny of sporangia and sporogenesis were very similar to the previously observed in Huperzia brevi- folia. Cutinisation occurs in early stages of development of sporangium cell walls, but in their final stages walls become lignified. As for the sporoderm development, the exospore is the first layer formed, composed by sporopollenin. The endospore deposits as a thin inner layer composed of cellulose, pectin and carboxylated polysaccharides. The perispore, if present, deposits at last. Mucopolysaccharides were found on the sporocyte coat and its abundance in sporangial cavity persists up to the immature tetrads stage, and then disappears. The lipids were abundant in the sporocytes, tetrads and spores, representing the main source of energy of the latter. In contrast, starch is not detected in the spores, but is abundant in premeiotic sporocytes and immature tetrads, developmental stages of high cellular metabolic activity. Intrinsic fluorescence corroborates the presence of lig- nin and cutin in the sporangium wall, while the sporopollenin is restricted to the exospore. The transfusion cells and the perispore are not always present. However, the processes of ontogeny and sporogenesis are extremely similar throughout the taxa studied, suggesting that they represent conservative family traits, nonspecific or generic. Rev. Biol. Trop. 62 (1): 273-298. Epub 2014 March 01. Key words: cutin, lignin, lipids, Lycopodiaceae, sporogenesis, sporopollenin, starch. 274 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Los Licófitos incluyen individuos hete- rospóricos, agrupados en los órdenes Isoetales y Selaginelales, e individuos homospóricos, reunidos en el orden Licopodiales. Actual- mente se los trata en conjunto como un grupo monofilético, diferente de los helechos o moni- lófitos debido a la presencia de microfilos, espermatozoides biflagelados y una inversión en el orden de algunos genes en el ADN de los cloroplastos que resulta similar al que se halla en briófitos, mientras que los megafilos, los espermatozoides pluriflagelados y la presencia de una inversión génica de 30Kb en una región del genoma del cloroplasto son caracteres compartidos por los monilófitos (Kenrick & Crane, 1997; Wikström & Kenrick,1997, 2001; Renzaglia, Duff, Nickrent & Garbary, 2000; Yatsentyuk, Valiejo, Samigullin, Wilkström & Troitsky, 2001; Smith, Pryer, Schuettpelz, Korall & Schneider, 2006). La familia Lycopodiaceae es cosmopolita y reúne aproximadamente 450 especies que crecen desde el nivel del mar hasta más de 4 000m de altitud. Arana & Øllgaard (2012) mencionan 190 especies para Sudamérica, mientras que para Colombia, se reconocen 78 especies distribuidas en todo el país con excep- ción de la Orinoquía (Murillo, Murillo, León & Triana, 2008). La familia fue subdividida por Wagner & Beitel (1992, 1993) en tres subfa- milias: Huperzioideae Wagner & Beitel, que reúne individuos diploides y tetraploides (con números cromosomáticos basados en x=33, 34, 36, 38, 42); Lycopodielloideae Wagner & Bei- tel, que agrupa los individuos presumiblemente diploides (con números cromosomáticos basa- dos en x=35, 55 y 78) y Lycopodioideae Wag- ner & Beitel, en la que se registran números cromosomáticos que incluyen n=30, 34, 32, 36 y también n=90 y 92 (éstos sólo en individuos de Lycopodium). En las últimas décadas se han genera- do numerosos aportes y la clasificación ha variado, aunque los cambios más destacables están relacionados con la interpretación de los taxones de nivel genérico. Holub (1964, 1975, 1983, 1985, 1991) segregó los géneros Aus- trolycopodium Holub, Diphasiastrum Holub, Lycopodiastrum Holub, Lycopodiella Holub, Pseudodiphasium Holub, Pseudolycopodiella Holub, Pseudolycopodium Holub, Laterista- chys Holub y agregó Phlegmariurus (Herter) Holub, a los previamente reconocidos Dipha- sium C. Presl ex Rothm., Huperzia Bernh., Lycopodium L., Palhinhaea Vasc. & Fran- co y Phylloglossum Kunze. Tryon & Tryon (1982) aceptaron dos géneros: Lycopodium, dividido en subgéneros y Phylloglossum, que posteriormente Christenhusz, Zhang & Schnei- der (2011) incluyeron en Huperzia. Øllgaard (1987, 1990, 1992) y Øllgaard & Windisch (1987) reconocieron Huperzia, Lycopodium y Lycopodiella en el Neotrópico, aunque subdi- vididos en grupos formales o informales más o menos coincidentes con los géneros propuestos por Holub (1964, 1975, 1983, 1985, 1991). Posteriormente, Haines (2003), propuso los géneros Dendrolycopodium Haines y Spinulum Haines y más recientemente, Øllgaard (2012 a, b), con base de las propuestas de Holub (1964, 1975, 1983, 1985, 1991), Wagner & Beitel (1992, 1993) y estudios moleculares de Wik- ström & Kenrick (2000, 2001), aceptó las tres subfamilias y segregó 16 géneros, nueve de los cuales citó para el Nuevo Mundo: Huperzia y Phlegmariurus (Huperzioideae), Lycopodiella, Pseudolycopodiella y Palhinhaea (Lycopodie- lloideae), Lycopodium, Diphasiastrum, Dipha- sium y Austrolycopodium (Lycopodioideae), sin considerar Dendrolycopodium ni a Spinu- lum (Haines, 2003) Otros estudios sobre las Lycopodiaceae, diversos en temas y enfoques, incluyen los tra- bajos de Rolleri (1972 a, b, 1975, 1979, 1980, 1981), Rolleri & Deferrari (1986), Whittier & Webster (1986), Santa (1986), Øllgaard (1975, 1987, 1988, 1992, 1996), Murillo & Harker (1990), Tryon & Stolze (1994), Murillo & Murillo (1999), Whittier (1998, 2003, 2006), Pita, De Menezes & Prado (2006) y Rolleri, Prada & Martínez (2010). Las primeras des- cripciones sobre la estructura y organización de los esporangios en Lycopodiaceae fueron realizadas por Sykes (1908). Wilce (1972) des- cribió las esporas de Lycopodium, Lycopodiella y Huperzia, proponiendo grupos basados en 275Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 la ornamentación, Øllgaard (1975) y Rolleri (1979) estudiaron la estructura y el modelo epidérmico de la pared del esporangio de las especies incluidas hasta ese momento en Lyco- podium, resaltando la importancia de estos caracteres en la sistemática. Sersic (1983) des- cribió la ontogenia de los esporangios y espo- rogénesis de Huperzia saururus (Lam.) Trevis., con datos sobre la dinámica de compuestos como almidón, lípidos, calosa, lignina y pecti- nas en el proceso. Uehara & Kurita (1991) estu- diaron el desarrollo y ultraestructura de la pared de las esporas de Lycopodium clavatum L. e incluyeron aspectos de la esporogénesis. Solé de Porta & Murillo-Pulido (2005) describieron las esporas de 30 especies de Lycopodiaceae, Gola (2008) analizó estrategias reproductivas y ontogenia de los esporangios en Huperzia, Wellman, Gensel & Taylor (2009) estudiaron la ontogenia y ultraestructura de la pared de la espora de licófitos fósiles y la compararon con la de la especie actual Lycopodium clavatum L. Por su parte, Rincón, Gélvez, Forero, Arrieta & Hleap (2009) describieron la ontogenia de los esporangios y la esporogénesis en H. brevifolia (Grev. & Hook.) Holub y, finalmente, Devi & Singh (2011) aportaron datos adicionales sobre la morfología de los esporangios y esporas en especies de Huperzia. Este trabajo describe la ontogenia de los esporangios y la esporogénesis en especies de seis géneros de la familia Lycopodiaceae que crecen en Colombia. Los autores consideran que para entender de forma clara y precisa las relaciones taxonómicas y sistemáticas dentro de la familia Lycopodiaceae, se requiere un mayor conocimiento y mejor evaluación de los caracteres diagnósticos anatómicos específicos así como de otros provenientes de la morfolo- gía esporal y la citología, analizar los límites de las especies, los presuntos híbridos y las espe- cies de origen híbrido. Por esas razones, se han reconocido aquí, para los efectos de este estu- dio, los géneros Diphasium, Diphasiastrum, Lycopodium, Lycopodiella y Palhinhaea., pero no la segregación sugerida para Huperzia (Øll- gaard 2012a, b), que se trata aquí incluyendo Phlegmariurus. Los taxones incluidos son los siguientes: Diphasium jussiaei (Desv. ex Poir.) Rothm., Diphasiastrum thyoides (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Holub, Huperzia arcuata B. Øllg., Huperzia attenuata (Spring) Trevis., H. brevifolia, Huperzia crassa (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Rothm., Huperzia reflexa (Lam.) Trevis., Huperzia firma (Mett.) Holub, Huper- zia phylicifolia (Desv. ex Poir.) Holub, Huper- zia rosenstockiana (Herter) Holub, Huperzia tetragona (Hook. & Grev.) Trevis., Lycopodie- lla andicola B. Øllg., Lycopodium clavatum y Palhinhaea cernua Franco & Vasc. Se analiza la presencia, momento de aparición e importan- cia de varios compuestos, tales como almidón, cutina, lignina, esporopolenina, mucopolisa- cáridos, y lípidos, durante estos procesos. Se detallan las etapas de la meiosis, con aportes de datos originales sobre la biología reproductiva de las Lycopodiaceae en general. MATERIALES Y MÉTODOS Se seleccionaron 14 taxones de seis géne- ros de Lycopodiaceae presentes en Colombia: nueve especies de Huperzia y una de cada género en el caso de Diphasiastrum, Dipha- sium, Lycopodium, Lycopodiella y Palhinhaea. Las localidades de recolecta, altitud y las refe- rencias de herbario de las especies estudiadas se incluyen en el cuadro 1. Los especímenes se determinaron utilizando claves y material bibliográfico disponible (Øllgaard, 1987, 1988, 1992; Øllgaard com. pers.), colecciones tipo y materiales de herbario. Los especímenes fueron depositados en los herbarios de la Universi- dad del Valle (CUVC) y de la Universidad de Antioquia (HUA). Para estudios de ontogenia esporangial y esporogénesis, se tomaron 30 estróbilos o tallos portadores de esporangios en el caso de especies sin estróbilo definido para cada uno de los taxones estudiados, y se fijaron en glutaraldehído al 2.5% en buffer fosfato, pH 7.2 y 0.2M durante 24-48hr a 6°C. Luego de la fijación, las muestras se lavaron en el mismo buffer y con agua destilada. Se deshidrataron durante una hora en cada etapa de la serie de etanol y durante 12hr en etanol al 100% a 6ºC 276 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 y se embebieron en etanol-resina LR White (London Resin®, UK), a 6ºC efectuándose varios cambios de resina pura durante séis días, en constante agitación. La resina fue polimeri- zada a 60°C por 24hr. Se obtuvieron secciones de 0.2-0.5µm con cuchillas de vidrio en ultra micrótomo Leica®, que se colorearon con azul de toluidina (TBO) en bórax al 1%, pH 3.6 por 30-60s. Con estos preparados se hicieron las descripciones sobre la ontogenia de los esporangios y esporogénesis. El TBO en con- diciones de metacromasia permite distinguir las paredes celulósicas primarias con polisacáridos carboxilados y ácido péctico, de cutina, lignina y esporopolenina, en la pared de los esporan- gios y en el esporodermo de las esporas en desarrollo o adultas (Southworth, 1973). Otros 30 estróbilos o tallos portadores de esporangios se fijaron en una mezcla de for- mol, etanol y ácido acético (FAA) por 24-48hr a 6°C, se cortaron en fragmentos de 2cm de longitud, se deshidrataron en la serie gradual de alcoholes y xilol (Ruzin, 1999) y se incluyeron en paraplast plus (Mc Cormick®) durante 12hr a 55°C. Se obtuvieron secciones longitudinales y transversales con micrótomo rotatorio Spen- cer 820, a 3-5µm, que se colorearon con azul de alcián-hematoxilina con el fin determinar la presencia de mucopolisacáridos asociados al proceso de esporogénesis y con safranina-verde rápido para descripciones adicionales. En esporangios no fijados y en diferentes etapas de maduración, se utilizó Sudán III para determinar la presencia de lípidos, solución de Lugol para almidón, azul de alcián para muco- polisacáridos, fluoroglucinol para lignina y orceína para poner en evidencia la dinámica de las figuras meióticas, todo lo anterior siguiendo los protocolos propuestos por Ruzin (1999). Para llevar a cabo las descripciones mor- fológicas con MEB el material se fijó en glutaraldehído y se deshidrató en 2.2 dime- toxipropano y se efectuó el desecado a punto crítico con un desecador SAMDRI®-795. Los estróbilos y los esporangios se montaron sobre cinta conductiva de carbono de doble cara y se CUADRO 1 Especies estudiadas y localidades de recolección TABLE 1 List of species studied and collection sites Especie Localidad Altitud (m) Colección testigo Diphasium jussiaei♦ Cauca 3 404 E.J. Rincón 0008 Diphasiastrum thyoides*♦ Cauca 3 376 E.J. Rincón 0009 Huperzia arcuata*♦ Caldas 3 677 E.J. Rincón 0004 Huperzia attenuata Cauca 3 404 E.J. Rincón 0010 Huperzia brevifolia*♦ Cauca 3 404 E.J. Rincón 0011 Huperzia crassa*♦ Caldas 3 677 E.J. Rincón 0012 Huperzia reflexa Valle del Cauca 1 950 E.J. Rincón 0013 Huperzia firma Cauca 3 376 E.J. Rincón 0014 Huperzia phylicifolia*♦ Cauca 3 376 E.J. Rincón 0015 Huperzia rosenstockiana* Caldas 3 677 E.J. Rincón 0003 Huperzia tetragona* Cauca 3 404 E.J. Rincón 0016 Lycopodiella andicola Valle del Cauca 1 950 E.J. Rincón 0005 Lycopodium clavatum* Cauca 3 404 E.J. Rincón 0007 Palhinhaea cernua*♦ Valle del Cauca 1 454 E.J. Rincón 0006 * Ejemplares seleccionados para la descripción de la ontogenia esporangial y esporogénesis. ♦ Ejemplares seleccionados para la descripción de las determinaciones químicas. 277Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 recubrieron con oro en una ionizadora DEN- TON VACUUM DESK IV durante 5min, y se observaron con un JEOL JSM-6490LV. Las secciones se examinaron con un microscopio fotónico Nikon 80i eclipse® equi- po con el sistema de contraste diferencial de interferencia (CDI) y esporangios en fresco con microscopio Nikon 90i eclipse® con los aditamentos de fluorescencia, empleando fil- tro UV-2A (filtro de excitación 330-380nm y filtro barrera 420nm) para la determinación de fluorescencia intrínseca de cutina, lignina y esporopolenina (Ruzin, 1999). Las fotografías se obtuvieron con cámara digital Nikon DS- 2MV® utilizando el programa NIS Elements versión 3.07 de Nikon. El procesamiento de las imágenes, se llevó a cabo con el programa Ima- gen-Pro Analyzer 6.3 de Media Cybernetics. En el curso del estudio, realizado se com- probó que los taxones seleccionados presentan un comportamiento similar durante la onto- genia de los esporangios y esporogénesis, así como similar respuesta a las determinaciones químicas efectuadas. Por ello, para la descrip- ción pormenorizada de los procesos se eligie- ron las especies que suministraron las mejores ilustraciones para cada caso. La terminología utilizada para las descripciones, se encuentra en Lellinger (2002), el término cubierta de los esporocitos se usa según Pettitt & Jeremy (1974) y Rincón et al. (2009). RESULTADOS Los esporangios maduros de las Lycopo- diaceae se distribuyen helicoidalmente sobre los ejes, protegidos por expansiones laminares (esporofilos) que forman estróbilos definidos, diferentes de los trofofilos o bien se dispo- nen en áreas caulinares en las que trofofilos no se diferencian morfológicamente o apenas se distinguen unos de otros (Fig. 1 A, B, C, D, E y F). En estos últimos casos, los ejes completos actúan fisiológicamente como un estróbilo y los esporangios se encuentran en toda su extensión. Los esporangios se originan en la axila de trofofilos o sobre la cara adaxial de esporofilos jóvenes cerca del sitio de inserción de estos al eje del estróbilo. A medida que los esporofilos maduran, los esporangios pueden mantener su posición o desplazarse y quedar ubicados cerca de la axila o en la zona medial del esporofi- lo. En Huperzia los esporangios son axilares (Fig. 1 A y B); en Lycopodium, Diphasium y Diphasiastrum se localizan cerca del sitio de inserción de los microfilos (Fig. 1 C y D); en Lycopodiella y Palhinhaea se ubican sobre la cara adaxial de los esporofilos. El esporangio es un eusporangio, con una cápsula y un pedicelo. La cápsula es reniforme, tiene pared múltiple y un área de dehiscencia, que es poco evidente en Lycopodiella y Palhin- haea (Fig. 1 E y F), y se une al tejido epidér- mico del eje o de los microfilos mediante un pedicelo más o menos grueso y relativamente corto. Los pedicelos más cortos se observaron en Lycopodiella y Palhinhaea y son comparati- vamente más largos en Huperzia, Lycopodium, Diphasium y Diphasiastrum. Ontogenia de los esporangios: Indepen- dientemente de su relación con microfilos o ejes, los esporangios maduran basípetamente, de modo que los más jóvenes se encuentran siempre en el ápice de los tallos o estróbilos y los maduros en la base (Fig. 2 A). Los esporangios inician su desarrollo a par- tir de un grupo de células epidérmicas situadas en un área del eje, próxima a la zona de emi- sión de los esporofilos (Fig. 2 B). Este grupo de células forma, por mitosis, un agregado de células indiferenciadas con citoplasma relati- vamente escaso, de granulación difusa, núcleos grandes y varios nucléolos. La diferenciación de estas células determina el establecimiento de dos estratos celulares: uno externo que dará origen a la pared del esporangio y uno interno que formará el tejido esporógeno y el pedicelo (Fig. 2 C). Las células del tejido esporógeno se encuentran densamente agrupadas en el espo- rangio, tienen contornos poligonales, núcleos grandes con varios nucléolos y citoplasma de aspecto granular y son capaces de experimentar abundantes mitosis (Fig. 2 D). 278 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 1. Posición de los esporangios en relación con ejes y apéndices en Lycopodiaceae. A. Huperzia crassa, esporangios largamente pedicelados axilares. B. Huperzia tetragona, esporangios cortamente pedicelados axilares. C. Lycopodium clavatum, esporangios cortamente pedicelados adaxiales sobre esporofilos. D. Diphasiastrum thyoides, esporangios cortamente pedicelados axilares a esporofilos. E. H. tetragona, esporofilo sustentando un esporangio. F. Palhinhaea cernua, esporofilo sustentando un esporangio. ce: cavidad esporangial; e: esporangios; es: esporofilos; et: eje del estróbilo; p: pared del esporangio; pe: pedicelo; sp: esporas; ta: tallo. Fig. 1. Position of sporangia relative to axes and appendages in the Lycopodiaceae. A. Huperzia crassa, longly pedicellate, axilar sporangia. B. Huperzia tetragona, shortly pedicellate, axilar sporangia. C. Lycopodium clavatum, shortly pedicellate sporangia adaxial on the sporophylls. D. Diphasiastrum thyoides, shortly pedicellate sporangia, axilar to the sporophylls. E. Huperzia tetragona, sporophyll sustaining sporangium. F. Palhinhaea cernua, sporophyll sustaining sporangium. ce: sporangial cavity; e: sporangia; es: sporophylls; et: strobilar axis; p: sporangium wall; pe: pedicel; sp: spores; ta: stem. 279Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 2. Ontogenia de los esporangios de Lycopodiaceae. A-E. Huperzia arcuata, ontogenia de los esporangios hasta la etapa de formación de los esporocitos. F-H. Esporangios maduros. F. Diphasiastrum thyoides. G. Huperzia phylicifolia. H. Palhinhaea cernua. cep: células del pedicelo lignificadas con engrosamientos escalariformes; e: esporangios; eg: tejido esporógeno; ep: células epidérmicas; es: esporofilos; esp: esporocitos inmaduros; ex: estrato celular externo; in: estrato celular interno; m: mitosis; nu: núcleos; p: pared del esporangio; pe: pedicelo; pd: células epidérmicas de la pared madura del esporangio; sp: esporas; t: tapete; ta: tallo. Fig. 2. Ontogeny of sporangia of Lycopodiaceae. A-E. Huperzia arcuata, ontogeny of sporangia to the stage of formation of the sporocytes. F-H. Mature sporangia. F. Diphasiastrum thyoides. G. Huperzia phylicifolia. H. Palhinhaea cernua. cep: pedicel lignified cells with scalariform thickenings; e: sporangia; ep: epidermal cells; eg: sporogenous tissue; es: sporophylls; esp: inmature sporocytes; ex: external cell layer; in: internal cell layer; mi: mitosis; nu: nuclei; p: sporangium wall; pe: pedicel; pd: epidermal cells of the mature sporangium wall; sp: spores; t: tapetum; ta: stem. 280 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Con el progreso de la diferenciación, el esporangio queda constituido por una pared de varios estratos celulares, incluido el tapete que se origina en el estrato más interno de esa pared y los esporocitos provenientes del tejido esporógeno (Fig. 2 E). Con la maduración posterior se desarrolla por completo el pedicelo, se diferencia la pared madura del esporangio y los esporocitos expe- rimentan meiosis formando tétradas de esporas que luego de su separación quedan libres en la cavidad esporangial (Fig. 2 F, G y H). En los pedicelos de Lycopodiella y Palhinhaea se observaron células de trasfusión cuyas paredes tienen engrosamientos escalariformes secun- darios, agrupadas en cordones que se conectan con el tejido vascular de los esporofilos. Estas células no se observaron en los taxones de otros géneros (Fig. 2 H). Desarrollo de la pared de los espo- rangios: En sus etapas iniciales, la pared del esporangio está constituida por un solo estrato de células aproximadamente cúbicas e isodiamétricas, con escaso citoplasma, nume- rosas vacuolas pequeñas, un núcleo grande eucromático en posición central y uno o dos nucléolos. Las paredes de estas células son primarias, celulósicas y dan una respuesta de color rosa claro a magenta ante la prueba con TBO (Fig. 3 A). Las células se dividen inicialmente sólo por planos anticlinales. Las posteriores divisio- nes en planos periclinales aumentan el núme- ro de estratos celulares de la pared. En esta etapa se aprecia una creciente abundancia de vacuolas aunque el núcleo y las paredes celu- lares permanecen sin cambios estructurales (Fig. 3 B). Las divisiones anticlinales y periclinales de las células de la pared del esporangio continúan hasta la formación de 3-4 estratos celulares que cubren por completo el tejido esporógeno. Las células de estos estratos tienen formas poligo- nales y contornos aproximadamente rectangu- lares, los núcleos se desplazan hacia posiciones excéntricas y numerosas vacuolas pequeñas presentes en el citoplasma, se fusionan para formar una o dos vacuolas grandes que ocupa la mayor parte del citoplasma (Fig. 3 C y D). El estrato celular más externo, que formará la pared madura del esporangio está formado por células epidérmicas de paredes primarias poco engrosadas, especialmente las periclina- les externas y en el citoplasma se encuentran abundantes plastidios con granos de almidón incluidos (Fig. 3 D). Con la maduración del esporangio, el estrato celular externo, que formará la pared madura, desarrolla engrosamientos en todas sus paredes celulares. Las pruebas citoquímicas sobre la composición aún indican que las célu- las tienen pared primaria compuesta por celulo- sa, polisacáridos carboxilados y ácidos pécticos y las respuestas ante el TBO son similares a las iniciales, pero se detecta un comienzo de cutinización cerca de la lámina media y en la superficie externa de las paredes periclinales, que reaccionan ante esas pruebas dando color azul púrpura (Fig. 3 E). En el citoplasma de estas células hay abundantes plastidios y una vacuola que ocupa la mayor parte del volumen celular. Los dos estratos celulares internos son similares al externo, pero carecen de engrosa- mientos en la pared primaria. El estrato celular más interno está formado por células con paredes primarias de contornos rectangulares con abundantes plastidios, numerosas vacuolas y un núcleo grande en posición central (Fig. 3 E). Este estrato celular se diferenciará para formar el tapete. Coincidiendo con la maduración de las tétradas, las células epidérmicas que forman la pared externa del esporangio desarrolla engrosamientos secundarios, más marcados en la pared periclinal interna, compuestos por una mezcla de cutina con lignina y que dan reacción de color azul oscuro a azul-violáceo con TBO (Fig. 3 F), estos engrosamientos son menos desarrollados en Lycopodiella y Palhinhaea. Las células del estrato que se encuentra inmediatamente por debajo también suelen engrosarse de manera similar. Para este momento, las células del tapete se han desarro- llado por completo, son algo globosas y tienen contornos subrectangulares, citoplasma con 281Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 3. Formación de la pared del esporangio en Lycopodiaceae. A-F. Huperzia arcuata. A. Pared indiferenciada del esporangio, con una capa celular. B-D. Desarrollo progresivo de la pared del esporangio. E-F. Etapas finales de la diferenciación de la pared y formación del tapete. G-H. Lycopodium clavatum. G. Colapso del tapete y capas celulares subyacentes, y liberación de esporas en la cavidad esporangial. H. Células epidérmicas de la pared madura del esporangio. ce: cavidad esporangial; ces: cubierta de los esporocitos; dp: división periclinal; eg: tejido esporógeno; ena: engrosamientos de las paredes anticlinales en células epidérmicas de la pared madura del esporangio; enb: engrosamientos de las paredes periclinales en células epidérmicas de la pared madura del esporangio; esp: esporocitos inmaduros; m: mitosis; nu: núcleos; or: orbículas; p: pared del esporangio; pd: células epidérmicas de la pared madura del esporangio; pp: pared periclinal; sp: esporas; t: tapete; tr: tétradas; va: vacuolas. Fig. 3. Formation of wall sporangium in the Lycopodiaceae. A-F. Huperzia arcuata. A. Undifferentiated sporangium wall, with a single cell layer. B-D. Progressive differentiation of the sporangium wall. E-F. Final stages of differentiation of the sporangium wall and tapetum formation. G-H. Lycopodium clavatum. G. Collapse of the tapetum and layers below, and sending spores into the sporangial cavity. H. Epidermal cells of the mature sporangium wall. ce: sporangial cavity; ces: sporocytes coat; dp: periclinal division; eg: sporogenous tissue; ena: thickenings in anticlinal walls of epidermal cells of mature sporangium wall; enb: thickenings in periclinal walls of epidermal cells of mature sporangium wall; esp: inmature sporocytes; m: mitosis, nu: nuclei; or: orbicules; p: sporangial wall; pd: epidermal cells of the mature sporangium wall; pp: periclinal wall; sp: spores; t: tapetum; tr: tetrads; va: vacuoles. 282 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 numerosos plástidios, vacuolas y un núcleo grande eucromático desplazado hacia la pared celular (Fig. 3 F). En la cavidad esporangial adyacentes al tapete se distinguen orbículas de esporopolenina evidenciadas por TBO. Una vez que las esporas han madurado, el tapete y demás estratos celulares que forman la pared el esporangio experimentan apoptosis y colapsan rápidamente (Fig. 3 G). Finalmente, cuando las esporas son liberadas, sólo persisten las células epidérmicas de la pared madura del esporangio (Fig. 3 H). Composición química y fluorescencia de las paredes de las cápsulas y pedicelos: Las paredes anticlinales externas de las células epidérmicas de la pared madura del esporangio, en vista superficial, emiten fluorescencia en el rango de longitud de onda azul que se atribuye a la presencia de cutina casi pura (Fig. 4 A). Estas paredes no se tiñen con fluoroglucinol ácido, pero si lo hacen las paredes periclinales internas y las anticlinales (Fig. 4 B y C), así como los engrosamientos escalariformes de las células de trasfusión de los pedicelos que sostienen los esporangios de Lycopodiella y Palhinhaea, indicando la presencia de lignina (Fig. 4 D). Las paredes periclinales externas también dan respuesta positiva con coloración anaranjada ante el Sudan III (Fig. 4 E). Los lípidos presentes en las paredes celulares de los esporangios confirman que se lleva a cabo una cutinización previa a la lignificación de la pared madura. Las paredes anticlinales y las periclinales internas, también dan respuesta positiva para lignina con TBO (Fig. 4 F). La lignina también es detectada con TBO en los engrosamientos escalariformes de las células de trasfusión de Lycopodiella y Palhinhaea dando la típica respuesta de color azul-verdoso (Fig. 4 G y H). Desarrollo de las esporas y maduración del esporodermo: El tejido esporógeno a tra- vés de repetidas mitosis, origina los esporocitos que una vez formados empiezan a separarse en el interior de la cavidad esporangial. Los esporocitos inmaduros o recién diferenciados del tejido esporógeno tienen pared primaria (la llamada cubierta de los esporocitos), son elip- soidales, con un núcleo grande central, varios nucléolos y un citoplasma con granulación fina y difusa (Fig. 5 A). Estas células madurarán para formar esporocitos premeióticos. Los esporocitos premeióticos quedan por completo libres en la cavidad esporangial, son aproximadamente elipsoidales o esféricos, tienen núcleo grande en posición central, cito- plasma de aspecto vacuolado, con abundantes granos de almidón y persiste la cubierta de los esporocitos que se tiñe de color magenta o rosa claro con TBO (Fig. 5 B). Al inicio de la meiosis, durante la profase I, el núcleo de los esporocitos tiene posición parietal y aspecto fibrilar, debido a la forma- ción del bouquet de cromosomas, mientras que en el citoplasma se aprecia una granulación fina y difusa. En esta etapa el tapete forma uno o, más raramente, dos estratos de células de contorno rectangular, núcleo grande eucromáti- co en posición central y citoplasma de aspecto vacuolado (Fig. 5 C y D). La meiosis de los esporocitos es simul- tánea. La primera división genera una célula 2-nucleada, sin pared entre los dos núcleos hijos. Al final de la profase I e inicio de la telo- fase I, la granulación citoplasmática se aprecia más hacia la periferia de la célula y al finalizar la división la granulación es homogénea en el citoplasma (Fig. 5 E). Durante la meiosis II, en metafase, los cromosomas forman dos masas densamente empaquetadas que se disponen perpendiculares una con la otra, y el comportamiento de los gránulos citoplasmáticos es similar al descrito anteriormente (Fig. 5 F); luego de separarse forman un cenocito 4-nucleado en el que es posible distinguir los dominios citoplasmáticos de las futuras esporas (Fig. 5 G). El exosporio se deposita al final de la meiosis II, quedando constituidas cuatro espo- ras que se disponen tetraédricamente y que permanecen juntas protegidas por la cubierta de los esporocitos (Fig. 5 H). El exosporio da una respuesta de color en la gama del azul claro intenso o casi turquesa ante el TBO, indicando 283Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 4. Determinaciones de compuestos químicos formados durante la esporogénesis. A. Fluorescencia intrínseca de la cutina en células epidérmicas del esporangio de Diphasiastrum thyoides (material en fresco). B-C. Lignina en células epidérmicas del esporangio de Diphasiastrum thyoides y Huperzia crassa respectivamente, prueba del fluoroglucinol (material en fresco). D. Lignina en células epidérmicas y células de trasfusión de los pedicelos del esporangio y esporofilo de Palhinhaea cernua, corte longitudinal, prueba del fluoroglucinol (material en fresco). E. Lípidos en células de la pared del esporangio de H. crassa, corte transversal, prueba del Sudán III (material en fresco). G-H. Lignina en células de trasfusión en tejido del pedicelo de Palhinhaea cernua, prueba del fluoroglucinol. ce: cavidad esporangial; cep: engrosamientos escalariformes lignificados en células del pedicelo; ena: engrosamientos de las paredes anticlinales en células epidérmicas de la pared madura del esporangio; enb: engrosamientos de las paredes periclinales en células epidérmicas de la pared madura del esporangio; es: esporofilos; nu: núcleos; pd: células epidérmicas de la pared madura del esporangio; pp: pared periclinal; sp: esporas; t: tapete; tr: tétradas; va: vacuolas. Fig. 4. Chemical compounds formed during sporogenesis. A. Cutin intrinsic fluorescence in epidermal cells of Diphasiastrum thyoides sporangium (fresh material). B-C. Lignin as phloroglucinol test in epidermal cells of Diphasiastrum thyoides and Huperzia crassa sporangium, respectively (fresh material). D. Lignin as phloroglucinol test in epidermal cells of sporangium, transfusion cells of the sporangium pedicels and sporophylls of Palhinhaea cernua, longitudinal section (fresh material). E. Lipids as Sudan III test in sporangium cell wall of H. crassa, transversal section (fresh material). G-H. Phloroglucinol test in transfusion cells of pedicel tissue in Palhinhaea cernua. ce: sporangium cavity; cep: scalariform thickenings in lignified cells of the pedicel; ena: thickenings in anticlinal walls of epidermal cells of mature sporangium wall; enb: thickenings in periclinal walls of epidermal cells of mature sporangium wall; es: sporophylls; nu: nuclei, pd: epidermal cells of the mature sporangium wall; pp: periclinal wall; sp: spores, t: tapetum; tr: tetrads; va; vacuoles. 284 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 5. Esporogénesis y formación del esporodermo de Lycopodiaceae. A-B. Huperzia arcuata, esporocitos inmaduros y premeióticos. C-D. H. arcuata, profase I, formación del bouquet de cromosomas. E. Lycopodium clavatum, meiosis I y II. F. Palhinhaea cernua, meiosis I y II. G. Huperzia phylicifolia, cenocito tetranucleado. H. Huperzia rosenstockiana, tétrada inmadura. buq: bouquet de cromosomas; ce: cavidad esporangial; cen: cenocito tetranucleado; ces: cubierta de los esporocitos; cr: cromosomas; ds: división simultánea; esm: esporocitos premeióticos; esp: esporocitos inmaduros; gra: granos de almidón; lip: vesículas lipídicas; meII: metafase II; mn: membrana nuclear; nu: núcleos; proI: final de la profase I; teI: telofase I; t: tapete; tr: tétradas. Fig. 5. Sporogenesis and sporoderm formation in the Lycopodiaceae. A-B. Huperzia arcuata, immature and premeiotic sporocytes. C-D. H. arcuata, prophase I and chromosome bouquet. E. Lycopodium clavatum, meiosis I and II. F. Palhinhaea cernua, meiosis I and II.G. Huperzia phylicifolia, 4-nuclear coenocyte. H. Huperzia rosenstockiana, immature tetrads. buq: chromosome bouquet; ce: sporangial cavity; cen: 4-nuclear coenocyte; ces: sporocyte coat; cr: chromosomes; ds: simultaneous division; esm: premeiotics sporocytes; esp: inmature sporocytes; gra: starch grains; lip: lipid vesicles; meII: metaphase II; mn: nuclear membrane; nu: nuclei; proI: end of prophase I; teI: telophase I; t: tapetum; tr: tetrads. 285Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 la presencia de esporopolenina (Fig. 6 A, B, C, D, E y F). A medida que las esporas maduran, en la superficie interna del exosporio se deposita una capa fina de material fibroso que se colorea de color rosa intenso a rosa-púrpura con TBO. Esta capa es más engrosada en la zona de la abertura de la espora y corresponde al endos- porio (Fig. 6 B, C, D, E y F). El exosporio se engrosa formando los patrones de ornamenta- ción característicos. En Lycopodiella y Palhinhaea se observó que en la superficie externa del exosporio se deposita un perisporio delgado de material granular fino que se tiñe de azul oscuro con TBO, el cual está ausente o no se deposita en otros taxones de Lycopodiaceae estudiados (Fig. 6 E). Al término de la esporogénesis, las espo- ras maduras permanecen en el interior de los esporangios y en estos solo persisten las células epidérmicas de la pared madura (Fig. 6 G). Observadas con microscopio de fluorescencia con filtro ultravioleta, las paredes externas de las esporas maduras de Lycopodiaceae emi- ten autofluorescencia en la longitud de onda correspondiente al amarillo, coincidiendo con la autofluorescencia de la esporopolenina en esas condiciones (Fig. 6 H). Almidón en el tejido esporógeno, espo- rocitos y esporas: El almidón se sintetiza desde etapas tempranas de la esporogénesis; en el citoplasma de las células del tejido esporóge- no, forma pequeños granos esféricos, escasos y oscuros por efecto de la coloración con solu- ción de Lugol (Fig. 7 A), los cuales aumentan en cantidad en los esporocitos inmaduros y premeióticos (Fig. 7 B y C). Al finalizar la meiosis, los granos de almidón se tornan esca- sos y rodean al núcleo de las esporas inmadu- ras en las tétradas recién formadas (Fig. 7 D). Conforme las esporas maduran, el almidón es consumido (Fig. 7 E y F). Lípidos en el tejido esporógeno, espo- rocitos y esporas: Los lípidos se encuentran sobre la superficie de las células esporógenas desde etapas tempranas del proceso de esporo- génesis. Se aprecian como glóbulos que reac- cionan dando color amarillento/anaranjado al reaccionar con el Sudán III (Fig. 8 A). A medi- da que los esporocitos maduran y se tornan premeióticos, los lípidos son más abundantes y forman una capa casi continua sobre la super- ficie interna de la cubierta de los esporocitos (Fig. 8 B y C). Hacia el final de la meiosis II, esta capa lipídica se introduce entre las esporas en desarrollo y disminuye progresivamente hasta desaparecer (Fig. 8 D). Los lípidos están presentes en el cito- plasma de las esporas inmaduras, formando grandes masas globulares (Fig. 8 E); a medida que estas maduran, las reservas de lípidos constituyen pequeños y abundantes glóbulos que ocupan la mayor parte del citoplasma y se rodean al núcleo (Fig. 8 F). Mucopolisacáridos en el tejido esporó- geno, esporocitos y esporas: Los mucopo- lisacáridos se acumulan entre las paredes de las células que forman el tejido esporógeno desde etapas tempranas de la ontogenia de los esporangios (Fig. 9 A). A medida que el tejido esporógeno se diferencia en esporocitos, los mucopolisacáridos son especialmente abun- dantes en la cavidad esporangial y disminuyen progresivamente con la maduración de las tétradas (Fig. 9 B y C). También la cubierta de los esporocitos presenta abundantes mucopoli- sacáridos durante todo el proceso de esporogé- nesis (Fig. 9 D, E y F). Las células epidérmicas que formarán la pared definitiva del esporangio en etapas inma- duras presentan abundantes mucopolisacáridos en sus paredes celulares (Fig. 9 G). A medida que las paredes anticlinales y la periclinal inter- na maduran y se lignifican, los mucopolisacári- dos gradualmente desaparecen (Fig. 9 H). Las pruebas químicas efectuadas y los compuestos determinados se resumen en el cuadro 2. DISCUSIÓN Según Rolleri (1972 a), Øllgaard (1987), Pita et al. (2006) y Arana & Øllgaard (2012), 286 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 6. Desarrollo del esporodermo de Lycopodiaceae. A. Huperzia rosenstockiana, tétradas inmaduras y esporas con exosporio. B. Huperzia arcuata y C. Palhinhaea cernua, tétradas con endosporio incipiente y exosporio desarrollado. D. H. arcuata, tétradas con endosporio y exosporio. E. P. cernua, tétradas con endosporio, exosporio y perisporio. F. Diphasiastrum thyoides, tétradas maduras, con endosporio y exosporio. G. Huperzia phylicifolia, esporas maduras. H. Diphasiastrum thyoides, fluorescencia intrínseca de la esporopolenina. ce: cavidad esporangial; ces: cubierta de los esporocitos; ed: endosporio; ex: exosporio; gra: granos de almidón; le: lesura; lip: depósitos lipídicos; nu: núcleos; or: orbículas; pd: células epidérmicas de la pared madura del esporangio; per: perisporio; sp: esporas; t: tapete; tr: tétradas. Fig. 6. Sporoderm development in the Lycopodiaceae. A. Huperzia rosenstockiana, immature tetrads and spores with exospore of. B. Huperzia arcuata, developing tetrads, with exospore, and incipient endospore. C. Palhinhaea cernua, developing tetrads, with exospore and incipient endospore. D. H. arcuata, mature tetrads with already formed endospore and exospore. E. P. cernua, mature tetrads with already formed endospore and exospore. F. Diphasiastrum thyoides, mature tetrads with already formed endospore and exospore. G. Huperzia phylicifolia, mature spores. H. Diphasiastrum thyoides, intrinsic fluorescence of sporopolenin with ultraviolet light. ce: sporangial cavity; ces: sporocytes coat; ed: endospore; ex: exospore; gra: starch grains; le: lesura; lip: lipid deposits; nu: nuclei; or: orbicules; pd: epidermal cells of the mature sporangium wall; per: perisporio; sp: spores; t: tapetum; tr: tetrads. 287Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 7. Granos de almidón en tejido esporógeno, esporocitos y esporas de Huperzia phylicifolia (material en fresco). A. Almidón escaso en el citoplasma del tejido esporógeno. B-C. Almidón en esporocitos inmaduros y premeióticos. D. Almidón en esporas inmaduras. E-F. Tétradas de esporas maduras sin almidón. ces: cubierta de los esporocitos; es: células del tejido esporógeno; esm: esporocitos premeióticos; esp: esporocitos inmaduros; gra: granos de almidón; lip: depósitos lipídicos; nu: núcleos; sp: esporas; tr: tétradas. Fig. 7. Starch grains in sporogenous tissue, sporocytes and spores of Huperzia phylicifolia (fresh material). A. Scarce starch of sporogenous tissue cytoplasm. B-C. Starch into immature and premeiotic sporocytes. D. Starch grains in immature spores. E-F. Tetrads of immature spores without starch grains. ces: sporocytes coat; es: cells of sporogenous tissue; esm: premeiotic sporocytes; esp: immature sporocytes; gra: starch grains; lip: lipid deposits, nu: nuclei; sp: spores; tr: tetrads. 288 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 8. Lípidos en el tejido esporógeno, esporocitos y esporas de Huperzia phylicifolia (material en fresco). A. Lípidos en la periferia del citoplasma de las células esporógenas. B-C. Capa uniforme y continua de lípidos entre los esporocitos y su cubierta. D. Lípidos en el citoplasma de esporas inmaduras. E. Lípidos en el citoplasma de esporas maduras. F. Lípidos abundantes en el citoplasma de esporas maduras. ces: cubierta de los esporocitos; es: células del tejido esporógeno; esm: esporocitos premeióticos; esp: esporocitos inmaduros; lip: depósitos lipídicos; nu: núcleos; sp: esporas; tr: tétradas. Fig. 8. Lipids in sporogenous tissue, sporocytes and spores of Huperzia phylicifolia (fresh material). A. Lipids in the periphery of sporogenous cells cytoplasm. B-C. Uniform, continuous layer of lipids between the sporocytes and sporocytes coat. D. Lipids in cytoplasm of immature spores. E. Lipids in cytoplasm of mature spores. ces: sporocytes coat; es: cells of sporogenous tissue ; esm: premeiotic sporocytes; esp: inmature sporocytes; lip: lipid deposits; nu: nuclei; sp: spores; tr: tetrads. 289Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 Fig. 9. Mucopolisacáridos en el tejido esporógeno, esporocitos y esporas de Huperzia phylicifolia. A. Mucopolisacáridos entre las células del tejido esporógeno. B-C. Mucopolisacáridos concentrados en la cavidad esporangial. D-F. Mucopolisacáridos concentrados en la cubierta de los esporocitos (material en fresco). G. Esporangios en desarrollo sin mucopolisacáridos en la cavidad esporangial. H. Pared madura engrosada del esporangio. ce: cavidad esporangial; ces: cubierta de los esporocitos; ena: engrosamientos de las paredes anticlinales en células epidérmicas de la pared madura del esporangio; enb: engrosamientos de las paredes periclinales en células epidérmicas de la pared madura del esporangio; es: células del tejido esporógeno; esm: esporocitos premeióticos; mu: mucopolisacáridos; nu: núcleos; p: pared del esporangio; pd: células epidérmicas de la pared madura del esporangio; sp: esporas; t: tapete; tr: tétradas. Fig. 9. Mucopolysaccharides in sporogenous tissue, sporocytes and spores of Huperzia phylicifolia. A. Mucopolysaccharides between sporogenous tissue cells. B-C. Concentration of mucopolysaccharides into the sporangial cavity. D-F. Concentration of mucopolysaccharides in the sporocyte coat (fresh material). G. Mature sporangia without mucopolysaccharides into the sporangial cavity. H. Adult wall of mature sporangium. ce: sporangial cavity; ces: sporocytes coat; ena: thickenings in anticlinal walls of epidermal cells of mature sporangium wall; enb: thickenings in periclinal walls of epidermal cells of mature sporangium wall; es: cells of sporogenous tissue; esm: premeiotic sporocytes; muc: mucopolysaccharides; nu: nuclei; p: sporangium wall; pd: epidermal cells of the mature sporangium wall; sp: spores; t: tapetum; tr: tetrads. 290 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 CUADRO 2 Pruebas realizadas y resultados obtenidos presentados en orden alfabético TABLE 2 Tests performed and obtained results presented in alphabetical order Compuesto Reactivo Reacción de color Proceso, etapa o sitio en el que se probó el compuesto (+, presencia; - ausencia) Almidón Solución de Lugol Azul-negro Citoplasma de células del tejido esporógeno (+), citoplasma de esporocitos y esporas inmaduras (+), esporas maduras (-), esporodermo (-) Cutina TBO Azul oscuro a púrpura Células epidérmicas de la pared madura de los esporangios (+) Esporopolenina TBO Azul verdoso claro (turquesa) Exosporio (+) Lignina Fluoroglucinol TBO Rojo Azul verdoso Células epidérmicas de la pared madura de los esporangios y células de transfusión en pedicelos de Lycopodiella (+), esporodermo (-) Lípidos y cutina Sudán III Amarillo- anaranjado Células esporógenas (+), citoplasma de esporocitos y esporas (+), superficie de los esporocitos (+), esporodermo (-), células epidérmicas de la pared madura de los esporangios (+) Mucopolisacáridos ácidos Azul alcián Azul claro Células esporógenas (+), cubierta de los esporocitos (+), cavidad esporangial con tétradas inmaduras (+) y con tétradas maduras (-). Células epidérmicas de la pared inmadura de los esporangios (+) y Células epidérmicas de la pared madura de los esporangios (-), esporodermo (-) Paredes primarias celulósicas TBO Rosa a magenta Cubierta de los esporocitos, paredes primarias y endosporio (+) los esporofilos de Lycopodiaceae pueden estar agrupados o no en estróbilos y los esporangios son solitarios, reniformes a subglobosos, uni- loculares, dehiscentes por un área transversal que los divide en dos valvas, y se encuentran ubicados sobre la cara adaxial o en la base de los esporofilos y maduran de forma basípeta. También se ha señalado que los esporangios se originan sobre la cara adaxial de los espo- rofilos jóvenes, cerca de su inserción en el eje caulinar, y que ontogénicamente derivan de un grupo reducido de células epidérmicas que por divisiones anticlinales y periclinales sucesivas conlleva a la formación del primordio del esporangio que continúan dividiéndose y dife- renciándose hasta la formación del esporangio maduro (Sykes, 1908; Rolleri, 1972 a, b; Bruce 1976 a; Sersic, 1983; Øllgaard, 1987; Uehara & Kurita, 1991; Gola, 2008; Rincón et al., 2009). Todos los rasgos descritos anteriormente coin- ciden con los hallazgos de esta investigación, y se comprueba que no existen variaciones apreciables, y por lo tanto se los considera caracteres de familia. La pared del esporangio en Lycopodia- ceae está formada por el estrato interno que formará el tapete, los estratos intermedios que degeneran con la madurez y el estrato celular externo. Este último es de especial interés ya que presenta engrosamientos en forma de “U” (Rolleri, 1972 a; Øllgaard, 1975; Sersic, 1983; Rincón et al., 2009). Aquí se observó que estos 291Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 engrosamientos se desarrollan a medida que las paredes anticlinales y la periclinal interna se lignifican, un proceso de diferenciación que confiere a la pared del esporangio la resistencia suficiente para contener el número creciente de esporas que sólo se liberarán en la madurez. Øllgaard (1987) señala que los engrosamien- tos de lignina están muy desarrollados en el estrato más externo de la pared del esporangio de Huperzia y Lycopodium, en tanto que son débiles o están ausentes en Lycopodiella (s. l.). Las observaciones de esta investigación indican que independientemente de su grado de desarrollo, los engrosamientos de lignina están siempre presentes en las células epidérmicas que forman la pared madura de los esporan- gios de todos los taxones analizados. Se ha señalado que en helechos leptosporangiados y algunos licófitos heterosporados, estos engro- samientos diferenciales de lignina facilitan la liberación de las esporas actuando a manera de “catapulta”, dispersándolas a cierta distancia de la planta madre (Moran, 2004; Noblin et al., 2012; Webster, 1995; Schneller, Gerber & Zup- piger, 2008). En Lycopodiaceae la liberación de las esporas ocurre por la separación de las dos valvas que forman el esporangio y podría estar relacionado con algún tipo de mecanismo fisiológico de colapso celular controlado. El tapete es una estructura presente en todas las plantas, aporta sustancias de reserva y otras, contribuyendo a la síntesis de precurso- res de la pared de las esporas y granos de polen. Uehara & Kurita (1991) y Rincón et al. (2009) sugieren que el tapete de L. clavatum y H. bre- vifolia contribuye a la formación de la pared de las esporas utilizando como vehículo de trans- porte el fluido presente en la cavidad esporan- gial. La presencia de orbículas en la cavidad del esporangio en las especies estudiadas podría dar apoyo a esta idea. En observaciones realiza- das con microscopía electrónica de trasmisión en D. thyoides se ha podido observar la secre- ción activa de orbículas a través del fluido de la cavidad esporangial en dirección de las tétradas en desarrollo, lo que confirmaría esa función secretora del tapete (Rincón et al. com. pers.) Sykes (1908) describió la presencia de células de paredes lignificadas en los pedicelos de los esporangios de Lycopodiella s.l. y sugi- rió su función de transfusión por proximidad con el haz vascular de los esporofilos. Gensel (1992) asignó también esa función al tejido vascular de los pedicelos esporangiales del género fósil Asteroxilon Kidst. & W.H. Lang. Las células similares halladas en especies de Lycopodiella y Palhinhaea tendrían la misma función. Análisis recientes de los estróbilos de P. cernua con MEB y MET confirman la conexión directa entre estas células de tras- fusión y el haz vascular de los esporofilos, así como, su naturaleza parenquimática y que permanecen vivas hasta la liberación de las esporas (Rincón et al. en prep.). La diferenciación y proliferación celulares que conducen a la formación de esporocitos premeióticos a partir de las células del tejido esporógeno han sido escasamente analizadas en Lycopodiaceae (Rolleri, 1972 a; Sersic, 1983; Rincón et al., 2009), por lo que los aportes de esta investigación constituyen un avance en el conocimiento de esos mecanismos en estos taxones. Los esporocitos presentan una capa o cubierta superficial (sporocyte coat, según Pettitt & Jermy, 1974) que se forma sobre las células madres de las esporas en los pteridófi- tos en general. Esta cubierta también fue des- crita por Sersic (1983), Uehara & Kurita (1991) y Rincón et al. (2009) en Lycopodiaceae. Estos últimos autores señalaron que en H. brevifolia la cubierta de los esporocitos se pierde en algún momento de la meiosis I y se vuelve a formar durante la meiosis II. Sin embargo, la evidencia surgida de esta nueva investigación indica que la cubierta de los esporocitos no se pierde en el curso de la meiosis y que la situación descrita previamente por estos autores podría explicarse por acción del fijador utilizado (FAA) en la pre- paración de las muestras. Resultados similares se observaron al fijar con este mismo compues- to los esporangios de Lycopodiaceae, en tanto que el material fijado con glutaraldehído con- servó intacta la cubierta de los esporocitos. La respuesta con TBO indica que la composición química corresponde a pared primaria tal como 292 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 lo sugiere Sersic (1983) para H. saururus y Uehara & Kurita (1991) en L. clavatum. La meiosis experimentada por los esporo- citos en Lycopodiaceae es simultánea y termina con la formación de una célula tetranucleada que posteriormente se separa en cuatro célu- las que forman la tétrada de esporas. Este comportamiento es similar a lo observado en otras especies de Lycopodiaceae (Sersic, 1983; Rincón et al., 2009), en briofitos y pteridofitos (Furness, Rudall & Sampson, 2002). Estos autores establecen que la división simultánea está relacionada con los grupos de plantas que producen esporas triletes en posición tetraé- drica y por ende, con el arreglo perpendicular de los paquetes de cromosomas que se obser- vó durante la metafase II de las especies de Lycopodiaceae analizadas. Aunque en algunos musgos y hepáticas que presentan división sucesiva, con paredes celulares separando los dos núcleos hijos después de la meiosis I, se forman tétradas de esporas en posición tetraé- drica (Furness et al., 2002). Por lo general, la división sucesiva se relaciona con la formación de tétradas de esporas en posición tetragonal, lineal, decusada y en forma de “T”. La división simultánea se considera un carácter ancestral y la sucesiva un carácter derivado que ha sur- gido de manera independiente a lo largo del proceso evolutivo, y los dos tipos de división se presentan en la microsporogénesis de todos los grupos de plantas (Furness et al., 2002; Blackmore, Wortley, Skvarla & Rowley, 2007; Simpson, 2010). Durante la profase I se observó el desarro- llo del bouquet de cromosomas, una condición común a todos los grupos de organismos vivos, incluidos plantas, animales y hongos (Harper, Golubovskaya & Cande, 2004; Ronceret & Pawlowski, 2010). Este arreglo temporal de los cromosomas tiene lugar sólo en la meiosis y consiste en la unión de todos los cromosomas en un punto de la membrana nuclear a través de los telómeros. La función del bouquet de cromosomas se ha relacionado con el apa- reamiento correcto de los mismos (Ronceret, Sheehan, & Pawlowski, 2008) y con su despla- zamiento rápido durante el zigóteno (Ronceret & Pawlowski, 2010). Dado que en Lycopodia- ceae la formación del bouquet de cromosomas coincide con otros organismos tanto en las características como en el momento del proce- so en el cual se produce, la función podría ser también la misma. Actualmente, son escasos los trabajos que describen el desarrollo y depósito de las capas que constituyen el esporodermo de las esporas de Lycopodiaceae (Lugardon, 1990; Tryon & Lugardon, 1991; Uehara & Kurita, 1991; Well- man et al., 2009). Estos autores concuerdan en que primero se deposita el exosporio, luego el endosporio y por último el perisporio, si este se desarrolla. Así mismo, también señalan que la esporopolenina es el principal componente del exosporio mientras que el endosporio está constituido por material fibrilar de naturaleza celulósica sin impregnaciones de esporopoleni- na. Según Southworth (1973) el TBO reacciona de forma diferencial con la esporopolenina y otros compuestos presentes en el esporodermo y permite determinarlos y distinguirlos. Aquí se han confirmado todas esas observaciones. La autofluorescencia amarilla intrínseca del exosporio maduro de Lycopodiaceae confir- mó también la presencia de esporopolenina. La reacción observada en las paredes de las células vegetativas, las células del tapete y el endosporio ante el TBO indican que se trata de materiales de pared primaria. La estructura del esporodermo maduro de las especies de Lycopodiaceae es similar a la descrita para L. clavatum por Uehara & Kurita (1991), excepto por la presencia del perisporio en las especies de Lycopodiella y Palhinhaea, algo que remite al llamado paraexosporio en el fósil homosporado Leclercquia complexa Banks, aunque su origen y composición serían diferentes (Lugardon, 1990; Wellman et al., 2009). Tryon & Tryon (1982) sugieren la presencia de perisporio en las esporas de L. clavatum del Neotrópico, en tanto que las observaciones de Uehara & Kurita (1991) a partir de material del Japón indican lo opuesto. En este trabajo y otras observaciones (Rincón et al. en prep.) las esporas de L. clavatum en 293Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 ejemplares procedentes de Colombia carecen de perisporio. Las esporas de Huperzia son foveoladas o fosuladas, mientras que las de Lycopodiella y Palhinhaea ruguladas o rugadas y las de Lycopodium, Diphasiastrum y Diphasium tiene ornamentación reticulada. Estos patrones de ornamentación observados concuerdan con las descripciones previas hechas por Wilce (1972), Øllgaard (1987), Tryon & Lugardon (1991), y Solé de Porta & Murillo-Pulido (2005). Sin embargo, los tipos de ornamentación observa- dos en la familia (Lellinger & Taylor, 1997) no coinciden con la marcada fragmentación gené- rica propuesta más recientemente (Øllgaard, 20012 a, b), pero sí podrían ser asumidas como caracteres de subfamilia, con algunas variacio- nes en los tipos agrupados en cada clase, algo que está en estudio para un trabajo próximo (Rincón et al. en prep.). En Lycopodiaceae el almidón se acumula inicialmente en el citoplasma de las células del tejido esporógeno, y luego en los esporocitos y tétradas de esporas inmaduras. El aumento en la concentración de almidón en etapas inicia- les de la esporogénesis, sugiere su utilización como fuente de energía a corto plazo y en eta- pas de gran actividad metabólica, algo que no es sólo propio de los licopodios (Rolleri, 1972 a; Ibars, Vilar, Iranzo & Salvo, 1988) sino de la mayoría de las plantas (Taiz & Zeiger, 2010). Sersic (1983) señala que el almidón también podría ser utilizado como precursor de mate- riales para la formación del esporodermo en H. saururus, hipótesis que no se contradice con lo observado en las especies en la presente inves- tigación y para las Lycopodiaceae en general. En los helechos se ha determinado que los triacilgliceroles pueden llegar a constituir entre el 25-79% del peso seco de las esporas (Gullvag, 1969; Gemmrich, 1977; Randi & Felippe, 1988; Raghavan, 1989; Ballesteros & Walters, 2007; Ballesteros 2011; Gabriel, Galán & Prada, 2011). Sersic (1983), Lugardon (1990), Uehara & Kurita (1991) y Rincón et al. (2009), observaron abundantes reservas lipí- dicas en el citoplasma de los esporocitos y las esporas de algunas especies de Lycopodiaceae. Estos hallazgos coinciden con los resultados de esta investigación, y sugieren la importancia de los lípidos como sustancias de reserva ener- gética de las esporas maduras en esta familia. Es posible que los lípidos observados en la superficie interna de la cubierta de los esporo- citos se utilicen también en la formación de la esporopolenina del esporodermo (Domínguez, Mercado, Quesada & Heredia, 1999; Piffa- nelli, Ross & Murphy, 1998, Eliseu & Dinis, 2008; Cronk, 2009; Ariizumi & Toriyama, 2011; Wallace, Fleming, Wellman & Beerling, 2011). Las abundantes reservas de lípidos en las esporas de Lycopodiaceae podrían también relacionarse con los largos períodos de latencia de las esporas no clorofílicas, que permanecen en el sustrato por periodos prolongados hasta entrar en contacto con los hongos micorrícicos necesarios para la germinación y desarrollo del gametófito no fotosintético (Raghavan, 1989; Whittier, 1998). A la fecha no hemos encontrado trabajos que determinen con exactitud la composición del fluido presente en la cavidad esporangial de los pteridófitos, y es desconocida la com- plejidad y la función de los mucopolisacáridos cuya presencia se determina durante el proceso de esporogénesis en las Lycopodiaceae. Estos mucopolisacáridos también fueron localizados en los canales mucilaginosos de los espo- rofilos y trofofilos de Lycopodium, Lycopo- diella y Palhinhaea. Bruce (1976 b) indica que los mucopoli- sacáridos presentes en los canales de mucilago podrían relacionarse con la protección del esporofito contra la desecación y con la acu- mulación de metabolitos, como una forma de evitar el ataque de herbívoros o, incluso, con el fin de ayudar a la liberación de las esporas al causar la reflexión de los esporofilos. Estas propuestas no carecen de probabilidad si se consideran el amplio rango altitudinal de estas especies y las características morfológicas y anatómicas poco eficientes en evitar la transpi- ración (Rolleri, 1975; Bruce, 1976 b). Teniendo en cuenta lo anterior, y dado que los muco- polisacáridos son especialmente abundantes en la cavidad esporangial durante las etapas 294 Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 tempranas de la esporogénesis, estos compues- tos podrían evitar la desecación de aquellas células más susceptibles a deshidratarse duran- te las etapas tempranas de la formación de las esporas. La capacidad de los mucopolisacári- dos como reguladores del contenido hídrico ha sido verificada en varios grupos de plantas bajo condiciones de estrés biótico y abiótico (Bruce, 1976b; Majdoub, Picton, Cerf & Roudesli, 2010; Ghanem et al., 2010). En la cavidad de los lóculos de las anteras de angiospermas se acumulan varios tipos de polisacáridos solubles y proteínas, originados en el tapete y necesarios para la hidratación y desarrollo de los granos de polen (Clément, Laporte & Audran, 1998; Castro & Clément, 2007; Pacini, 2010), de modo que es posible que los mucopolisacáridos presentes en la cavidad esporangial de Lycopo- diaceae funcionen igualmente como compues- tos de pasaje entre el tapete y las células en desarrollo, incluso, aportando constituyentes indispensables para el desarrollo de las espo- ras y de su pared. También es posible que los mucopolisacáridos tengan alguna intervención en la apertura de las dos valvas que forman la pared madura de los esporangios, ya que desaparecen por completo una vez éstos han madurado, podrían, por ausencia, conducir a una desecación del área de abertura y facilitar la separación de las valvas, tal como observó Pacini (2010) durante la dehiscencia de las anteras. Finalmente, además de los aportes realiza- dos sobre aspectos anatómicos y funcionales, la conclusión amplia de este trabajo permite establecer que hay pocas variaciones aprecia- bles en la ontogenia de los esporangios y la esporogénesis de Lycopodiaceae. Los eventos descritos no son estrictamente específicos o genéricos, sino rasgos de familia que apuntan a la uniformidad de estos taxones en relación con su biología reproductiva. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a las siguientes ins- tituciones y personas: Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia (UdeA- laboratorio de Botánica), Departamento de Biología Uni- versidad del Valle (UNIVALLE-Sección Botá- nica), Unidad de Microscopía Electrónica de la Universidad del Cauca (UNICAUCA), Labora- torio de Microscopía Eléctrica de Barrido de la Escuela de Materiales (UNIVALLE), a Silvia Espinosa Matías de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) por su aporte con algunas imágenes en MEB y a Sayonara Plata (UdeA) por su colaboración en la edición fotográfica. Este estudio forma parte de una serie de trabajos que integrará la Tesis Docto- ral del primer autor, quien agradece también a Benjamin Øllgaard (Universidad de Aarhus, Dinamarca) por su valiosa ayuda en la identi- ficación de algunos especímenes y suministro de material bibliográfico y a Ricardo Callejas (Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia, UdeA) por sus acertados comenta- rios y sugerencias al manuscrito final. RESUMEN Los estudios sobre aspectos reproductivos no son muy abundantes en la literatura científica sobre los taxones de Lycopodiaceae y constituyen información esencial para apoyar la taxonomía y relaciones sistemáticas en el grupo. Por lo tanto, se presenta aquí un análisis detallado de la ontogenia de los esporangios y esporogénesis, así como determinaciones químicas de varios compuestos generados durante la formación de las esporas. Los análisis se lle- varon a cabo en 14 taxones de seis géneros de la familia: Diphasiastrum, Diphasium, Huperzia (un género que se trata aquí, incluyendo Phlegmariurus), Lycopodiella, Lyco- podium y Palhinhaea. Las muestras fueron recolectadas en tres departamentos de los Andes de Colombia entre 1 454-3 677m de altitud. La ontogenia se estudió en trozos de estróbilos y ejes, de 1cm de largo, que se fijaron en glu- taraldehido o FAA, se deshidrataron en alcohol, se inclu- yeron en LR White, se seccionaron en cortes de 0.2-0.5μm y se colorearon con azul de toluidina (TBO), un colorante metacromático que permite detectar tanto esporopolenina como lignina o sus precursores. Para estudios adicionales, secciones de 3-5μm de material incluido en paraplast plus se colorearon con safranina-verde rápido y azul alcián- hematoxilina. Las pruebas químicas se llevaron a cabo en secciones de esporangios sin fijar en diferentes etapas de madurez utilizando azul alcián (mucopolisacáridos), solu- ción de Lugol (almidón), Sudán III (lípidos), fluoroglucinol (lignina) y orceína (cromosomas). Las observaciones se efectuaron con microscopio fotónico equipado con con- traste diferencial de interferencia (DIC) y microscopía de fluorescencia (para esporas y pared de los esporangios sin 295Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 62 (1): 273-298, March 2014 colorear). Para observaciones con microscopía electrónica de barrido (MEB), los estróbilos y esporangios se deshi- drataron con 2,2 dimetoxipropano, se desecaron a punto crítico y se metalizaron con oro. Los resultados indican que la ontogenia de los esporangios y esporogénesis es muy similar a la observada previamente en Huperzia bre- vifolia. En las primeras etapas de desarrollo, las paredes celulares de la epidermis del esporangio se cutinizan y en las finales se lignifican. En el desarrollo del esporodermo, la primera capa que se forma es el exosporio, compuesto por esporopolenina. El endosporio es una capa interna delgada compuesta de celulosa, pectina y polisacáridos car- boxilados. El perisporio, si está presente, es la última capa que se deposita. Los mucopolisacáridos se encontraron en la cubierta del esporocito, son abundantes en la cavidad esporangial hasta la etapa de tétradas inmaduras y luego desaparecen. Los lípidos son abundantes en esporocitos, tétradas y esporas, y representan la principal fuente de energía de estas. En contraste, el almidón no se detecta en las esporas pero es abundante en esporocitos premeióticos y tétradas inmaduras, ambos con gran actividad metabóli- ca. La fluorescencia intrínseca corrobora la presencia de lignina y cutina en la pared del esporangio, mientras que la esporopolenina se limita al exosporio. Las células de transfusión y el perisporio no siempre están presentes. Sin embargo, los procesos de la ontogenia y esporogénesis son extremadamente similares en todos los taxones estudiados, lo que sugiere que representan rasgos típicos de familia, no específicos ni genéricos. Palabras clave: almidón, cutina, esporogénesis, esporopo- lenina, lignina, lípidos, Lycopodiaceae. REFERENCIAS Arana, M. D. & Øllgaard, B. (2012). Revisión de las Lyco- podiaceae (Embryopsida, Lycopodiidae) de Argenti- na y Uruguay. Darwiniana, 50(2), 266-295. Ariizumi, T. & Toriyama, K. (2011). Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine develop- ment. Annual Review of Plant Biology, 62, 437-460. Ballesteros, D. (2011). Conservation of fern spores. In H. Fernandez, A. Kumar & M. A. 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