0 CALIBRACIÓN IN SITU DEL INDICADOR FLUORESCENTE MAG-FLUO-4 EN CÉLULAS MUSCULARES DE RATÓN ANDRÉS FELIPE MILÁN TABARES Grupo PHYSIS, Universidad de Antioquia TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito para optar al título de MAGÍSTER EN MICROBIOLOGÍA Y BIOANÁLISIS ÉNFASIS BIOQUÍMICA ASESOR Juan Camilo Calderón Vélez. PhD Departamento de Fisiología y Bioquímica, Universidad de Antioquia Coordinador grupo PHYSIS, Universidad de Antioquia COMITÉ TUTORIAL Marco Antonio Giraldo Cadavid. PhD Instituto de Física. Universidad de Antioquia Grupo Biofísica y PHYSIS, Universidad de Antioquia María Patricia Arias Gutiérrez. MSc. PhD Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad CES Grupo PHYSIS, Universidad de Antioquia UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA Y BIOANÁLISIS MEDELLÍN JUNIO DE 2019 1 Calibración in situ del indicador fluorescente Mag-Fluo-4 en células musculares de ratón Resumen Introducción: El Ca2+ es un elemento clave en el mecanismo de acoplamiento excitación contracción de las células musculares; su aparición y desaparición en el  citoplasma se puede registrar utilizando indicadores fluorescentes como el Mag- Fluo-4. Los registros de la cinética del Ca2+ citoplasmático obtenidos con este indicador no se han presentado en términos de concentración de Ca2+, pues no se conoce la Fmin, Kd y Fmáx del indicador in situ, parámetros que permiten la calibración de la señal utilizando la ecuación propuesta por Grynkiewicz, Poenie & Tsien en 1985. Objetivo: Determinar in situ los parámetros que permitan calibrar las señales de fluorescencia obtenidas con Mag-Fluo-4 a valores de Ca2+ en células musculares. Metodología: Se obtuvieron células del músculo flexor digitorum brevis (FDB) por disociación enzimática de 16 ratones C57BL/6J, se montaron en una cámara experimental con electrodos, sobre la platina de un microscopio invertido acoplado a una lámpara LED para la iluminación y a un juego de filtros, un fotomultiplicador y un digitalizador para registrar las señales. Para determinar la autofluorescencia se estimularon con luz LED células sin cargar con el indicador. Las células se cargaron con 6 µM de Mag-Fluo-4, AM por 10 min a temperatura ambiente y se registraron los transitorios de fluorescencia de Ca2+, se permeabilizaron con Saponina (o con Ionomicina en un subgrupo de células) y se expusieron a Tyrode 0 mM de Ca2+, solución calibradora de Ca2+ o Tyrode 100 mM de Ca2+, todas sin Mg2+, para determinar la Fmin, Kd o Fmáx, 2 respectivamente. Para hallar la compartimentalización del indicador se utilizó Tritón X-100. En todas las soluciones se utilizó 4-Metil-N-(fenilmetil) benzenosulfonamida (BTS) para inhibir la contracción muscular. A partir de estos valores se expresaron los transitorios de fluorescencia de Ca2+ en términos de la concentración de Ca2+. Resultados: Se obtuvieron células alargadas, con patrón estriado, refringentes, que respondieron con acortamiento ante el estímulo eléctrico. Las células presentaron una autofluorescencia de 0,046±0,013 U.A. (n=6). Determinamos in situ que el Mag-Fluo-4 tiene una Fmin corregida (n=10) de 0,14±0,097 U.A, una compartimentalización del 1,1±0,7 % (n=10), una Kd de 118,9 µM, una Fmáx corregida de 150,889±8,798 U.A. (n=8) al permeabilizar con Saponina y de 102±27,402 U.A. (n=9) al permeabilizar con Ionomicina. La Fmáx corregida para estos dos últimos compuestos fue significativamente diferente (P<0.05). Para una señal promedio de 14 transitorios de fluorescencia, calculamos una concentración de Ca2+ libre basal en el citoplasma de 171±0,008 nM y un pico en la concentración de Ca2+ libre tras el estímulo eléctrico de 17,37±4,1 µM. La respuesta a BTS y la cinética de los transitorios sugiere que trabajamos exclusivamente con fibras tipo IIX. Conclusiones: Los parámetros para la calibración de un indicador fluorescente varían considerablemente según la metodología utilizada. Logramos determinar los parámetros in situ del Mag-Fluo-4 en células de FDB y expresar los transitorios de fluorescencia de Ca2+ en términos de concentración de Ca2+. Nuestros hallazgos tienen aplicaciones para interpretar resultados futuros y ya publicados con este indicador en los cuales las señales se han reportado únicamente como cambios de fluorescencia. 3 Palabras claves: Ca2+, Calibración in situ, Mag-Fluo-4, flexor digitorum brevis, microscopía de fluorescencia, músculo esquelético. Lista de abreviaciones ∆F: cambio de la fluorescencia con respecto a la fluorescencia basal AEC: acoplamiento excitación-contracción ATP: adenosín trifosfato BTS: 4-Methyl-N-(phenylmethyl) benzenesulfonamide CaV1.1: canales de Ca2+ tipo L CPA: ácido ciclopiazónico DHPR: dihydropyridine receptor DI: densidad integrada DIC: densidad integrada corregida EDL: extensor digitorum longus F: fluorescencia experimental Fbasal corregida: fluorescencia basal corregida Fbasal: fluorescencia basal FDB: flexor digitorum brevis Fmáx corregida: fluorescencia máxima corregida del indicador Fmáx: fluorescencia máxima del indicador 4 Fmin corregida: fluorescencia mínima corregida del indicador Fmin: fluorescencia mínima del indicador I: indicador fluorescente IL: indicador libre IT: indicador total Kd: constante de disociación MCU: mitochondrial Ca2+ uniporter NCX: sodium-calcium exchanger PMCA: plasma membrane Ca2+ ATPase R: ruido RS: retículo sarcoplásmico RyR: receptores de rianodina SERCA: sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SIU: sede de investigación universitaria U.A.: unidades arbitrarias de fluorescencia 5 Introducción Desde la segunda mitad del siglo XIX los músculos y las células musculares esqueléticas se han clasificado teniendo en cuenta propiedades fisiológicas como el color, en rojos y blancos; la velocidad de contracción y relajación, en rápidos o  lentos;  la  fatigabilidad, etc.  (Barnard et al. 1971; Burke et al. 1971; Close, 1972;  Bottinelli & Reggiani, 2000). En la década de 1960 surgió un esquema más complejo para la clasificación de las células musculares como resultado de la correlación de estudios de diferentes líneas de investigación: estudios bioquímicos, histoquímicos y fisiológicos de unidades motoras. La utilización de técnicas de microscopía electrónica, la medición de la actividad de enzimas como la succinato deshidrogenasa (SDH), la glicerofosfato deshidrogenasa (α-GPD) y la ATPasa de miosina (Dubowitz & Pearse,  1960;  Engel,  1962;  Stein  &  Padykula,  1962;  Guth  &  Samaha,  1969;  Brooke & Kaiser, 1970; Peter et al. 1972), dieron como resultado la clasificación de los tipos de fibras en tipo I (anteriormente llamados rojos o lentos) y en tipo IIA y IIB (anteriormente llamados blancos o rápidos). Posteriormente se clasificó un tercer tipo de fibra rápida con la identificación de una cadena pesada de miosina (MHC) diferente a la IIA y IIB, llamada por algunos IID  (Bar  &  Pette,  1988;  Termin,  Staron & Pette et al. 1989) y por otros IIX (Schiaffino et al. 1988; 1989). También se determinó que existen fibras intermedias (conocidas como híbridas), las cuales contienen al menos dos tipos de miosinas (Staron & Pette, 1993; Bottinelli & Reggiani, 2000). 6 Muchas de las propiedades de los tipos de fibras afectan o se ven afectadas por la diferencia en la cinética de la señalización del Ca2+ y la maquinaria molecular involucrada en el fenómeno de acoplamiento excitación-contracción (AEC) (Baylor & Hollingworth 2003; Calderón et al. 2009). El AEC en el músculo esquelético representa una comunicación rápida entre los eventos eléctricos que ocurren en la membrana plasmática y la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico (RS), lo cual lleva a la contracción muscular (Sandow, 1952; Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). La secuencia de eventos del AEC en el músculo esquelético inicia con un potencial de acción que se propaga longitudinalmente a lo largo de la célula y transversalmente a través de los túbulos T. Estos cambios en el potencial de membrana son detectados por los canales de Ca2+ tipo L (CaV1.1) (Ziman et al. 2010) o receptores de dihidropiridinas (DHPR, Dihydropyridine receptor) (Lamb, 1992), proteínas que en el músculo esquelético funcionan básicamente como sensores de voltaje ubicados en los túbulos T. Los DHPR transmiten la señal a los receptores de rianodina (RyR) presentes en el RS (Stephenson, Lamb & Stephenson, 1998;  Fill  &  Copello,  2002;  Protasi,  2002) ocasionando un cambio conformacional en los RyR y la liberación de Ca2+ desde el RS hacia el citoplasma (Caputo, Bolaños & González, 2004; Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). Los RyR son canales de Ca2+ regulados por adenosín trifosfato (ATP), el ion Mg2+, el mismo ion Ca2+, el estado de óxido-reducción, el estado de fosforilación/desfosforilación y por otras proteínas (Lai, et al. 1988; Fill & Copello,  7 2002;  Wei et al. 2006;  Bleunven  et al. 2008;  Prosser  et al. 2008;  Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). El aumento transitorio de la concentración de Ca2+ en el citoplasma y su interacción con la troponina C suspende la inhibición que la troponina I y la tropomiosina ejercen sobre la interacción actina-miosina, lo que permite el deslizamiento de los filamentos delgados sobre los gruesos y genera la tensión (Ebashi, 1974). La subsecuente activación del sistema amortiguador de Ca2+ y del aparato contráctil termina con la disminución y rápida recaptura del Ca2+ citoplasmático. El Ca2+ basal en el citoplasma tiene una concentración aproximadamente de 100 nM y en el espacio extracelular de 2 mM (Bers, 2018). El sistema es capaz de mantener este gradiente transportando Ca2+ al exterior de la célula a través del intercambiador Na+-Ca2+ (NCX, Sodium-calcium exchanger) (Hidalgo, Cifuentes & Donoso, 1991) y la bomba de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA, Plasma membrane Ca2+ ATPase) (Cully et al. 2016). En el citoplasma el Ca2+ es capturado por la proteína amortiguadora de Ca2+ parvalbúmina (Schwaller, 2012). La bomba de Ca2+ del RS (SERCA, Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) regresa el Ca2+ al RS (Toyoshima & Mizutani, 2004). Las mitocondrias capturan el Ca2+ rápidamente a través de la proteína transmembrana uniporter de Ca2+ mitocondrial (MCU, Mitochondrial calcium uniporter) (Barrige, Bootman & Roderick, 2003). Todos estos mecanismos 8 aseguran la relajación del músculo esquelético y le permite estar listo para responder ante un nuevo estímulo. La participación del Ca2+ en procesos fisiológicos ha impulsado el desarrollo de metodologías para su detección intracelular en células vivas (Hu, Yu & Yu, 2005). La salida y remoción del Ca2+ en el citoplasma puede documentarse por microscopía de fluorescencia cuantitativa mediante la obtención de señales de intensidad lumínica en función del tiempo, que son conocidas como transitorios de fluorescencia de Ca2+. Estas señales son la respuesta de moléculas denominadas indicadores fluorescentes de Ca2+. Las primeras mediciones confiables de Ca2+ intracelular fueron realizadas por Ridgway & Ashley en 1967 inyectando la fotoproteína aequorina en células musculares de Balanus nubilus. Posteriormente, a principios de la década de 1980 Tsien y sus colaboradores desarrollaron varios indicadores fluorescentes (Grynkiewicz, Poenie & Tsien, 1985), lo cual impulsó las investigaciones de los fenómenos intracelulares relacionados con Ca2+ (Hu, Yu & Yu, 2005). Para estudiar los cambios de Ca2+ intracelular durante la contracción en músculo esquelético se han utilizado diferentes indicadores fluorescentes de Ca2+ (Tabla 1) como Fura-2 (Westerblad & Allen,1991; Hu, Yu & Yu, 2005; Darbellay et al. 2011, Cully et al. 2012), Mag-Fura-2 (Konishi et al. 1991; Delbono & Stefani, 1993; Hollingworth, Gee & Baylor, 2009), Indo-1 (Jacquemond,  1997;  Andrade, Reid & Westerblad, 2001; Hu, Yu & Yu, 2005; Zhou et al. 2006; Prosser et al. 2008; Kerr et al. 2013; López et al. 2015), Mag-Fura-5 (Delbono & Stefani, 1993; Szentesi et al. 1997), Fluo-3 (Caputo  &  Bolaños,  1994; Calderón, Bolaños & Caputo, 2011), 9 Fluo-4 (Prosser et al. 2008, Ríos et al. 2008; Ackermann et al. 2011; Kerr et al. 2013), Rhod-5N (Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Cully et al. 2016), Fluo-5N (Ziman et al. 2010; Cully, Edwards & Launikonis, 2014) o Mag-Fluo-4 (Caputo, Bolaños & González, 2004; Capote et al. 2005; Calderón et al. 2009; Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a; Baylor & Hollingworth, 2011; Calderón, Bolaños & Caputo, 2011;  Wei-LaPierre et al. 2013;  Calderón, Bolaños & Caputo, 2014; López et al. 2015). Los indicadores fluorescentes tienen diferentes propiedades (Tabla 1), en general, pueden dividirse según sean relaciométricos o no-relaciométricos (Kao, Li & Auston, 2010). Los no-relaciométricos, como el Mag-Fluo-4, pueden excitarse con luz visible y se caracterizan porque al unirse al Ca2+ la longitud de onda a la cual presentan la máxima excitación o emisión no cambia; cuando se unen a Ca2+ estos indicadores presentan cambios solamente en la intensidad de fluorescencia. Dentro de los no-relaciométricos hay varias moléculas que tienen afinidades por el Ca2+ en el orden micromolar, lo cual permite su uso para estudiar Ca2+ dentro de células musculares (Hollingworth, Gee & Baylor, 2009;  Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). En este grupo el Mag-Fluo-4 exhibe ventajas dado su cinética rápida, una constante de disociación (Kd) in vitro de 22 μM, un espectro de 10 Tabla 1. Propiedades in vitro de algunos indicadores fluorescentes de Ca2+ utilizados en músculo esquelético. * Datos reportados por el fabricante Thermo Fisher Scientific Indicador Afinidad por el Ca2+* Kd para Ca2+/Mg2+ (μM)* Excitación– Emisión (nm)* Relaciométrico Ejemplos de uso en investigaciones Fluo-3 Alta 0,325/0 506-526 No Caputo & Bolaños, 1994;  Calderón,  Bolaños  & Caputo, 2011. Fluo-4 Alta 0,345/0 494-516 No Prosser et al. 2008, Ríos et al. 2008;  Ackermann et al. 2011; Kerr et al. 2013. Fluo-5N Baja 90/0 494-516 No Ziman et al. 2010; Cully, Edwards & Launikonis, 2014. Fura-2 Alta 0,14/0 336/366-500 Sí Westerblad & Allen, 1991; Hu, Yu & Yu, 2005;  Darbellay et al. 2011, Cully et al. 2012. Indo-1 Alta 0,23/0 345-480/415 Sí Jacquemond,  1997;  Andrade,  Reid  &  Westerblad,  2001;  Hu, Yu  & Yu,  2005;  Zhou  et al. 2006;  Prosser  et al. 2008;  Kerr  et al. 2013; López et al. 2015. Mag-Fluo-4 Baja 22/4700 490-517 No Caputo,  Bolaños  &  González,  2004;  Capote  et al. 2005;  Calderón  et al. 2009;  Hollingworth,  Gee  &  Baylor,  2009;  Calderón,  Bolaños & Caputo, 2010a; 2011; 2014; Baylor  &  Hollingworth,  2011;  Wei-LaPierre et al. 2013; López et al. 2015. Mag-Fura-2 Baja 25/1900 369/329-511 Sí Konishi et al. 1991; Delbono & Stefani, 1993;  Hollingworth, Gee & Baylor, 2009. Rhod-5N Baja 320/0 551-576 No Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Cully et al. 2016. 11 excitación con luz visible, una eficiencia cuántica relativamente alta, mayor que el Oregon Green Bapta 5N (OGB-5N), Fura-5N, Rhod-5N y menor que el Rhod-2 y el Fluo-3 (Caputo,  Bolaños  &  González,  2004;  Hollingworth, Gee & Baylor, 2009;  Calderón, Bolaños & Caputo, 2011; 2014). La principal desventaja de los indicadores no relaciométricos radica en que al registrar la señal de fluorescencia a una sola longitud de onda los cambios en la señal derivados de factores no relacionados con Ca2+, como una alteración en el tamaño de la célula o fuga de indicador, puede alterar la interpretación de los datos (Kao, Li & Auston, 2010). Los indicadores relaciométricos, por otro lado, no sólo muestran un cambio en la intensidad, sino también en la longitud de onda en la cual se dan los máximos de excitación o emisión. Los compuestos relaciométricos tienen algunas desventajas, el Fura-2, por ejemplo, requieren excitación con dos longitudes de onda en el rango ultravioleta, lo cual hace que la instrumentación sea bastante compleja. Otra desventaja es que muchas preparaciones biológicas son autofluorescentes y esto puede generar artefactos en las señales. Su ventaja radica en el hecho de que la señal definitiva de Ca2+ deriva de la relación entre las señales de fluorescencia generadas para las formas del indicador libre de Ca2+ y unido a Ca2+, y eso minimiza algunos artefactos que no están relacionados con la concentración de Ca2+ (Kao, Li & Auston, 2010). Los indicadores fluorescentes de Ca2+ se han utilizado ampliamente para estudiar el AEC en el músculo esquelético de mamíferos, en particular de roedores (Baylor & Hollingworth, 2011). Desafortunadamente, los cambios en las concentraciones de Ca2+ citoplasmático reportadas en respuesta a un potencial de acción en un 12 mismo tipo de célula varían mucho de un estudio a otro. Esto puede deberse a la elección del indicador fluorescente (Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). En las células musculares los cambios en la concentración de Ca2+ citoplasmático provocados por un potencial de acción son grandes y breves, por lo tanto, para lograr una estimación precisa de la amplitud y el curso en el tiempo del cambio de las concentraciones de Ca2+ se debe emplear un indicador de respuesta rápida y baja afinidad por el Ca2+ (Hirota et al., 1989; Konishi, Suda & Kurihara, 1993). Un indicador de Ca2+ se puede considerar de baja afinidad cuando tiene una Kd para el Ca2+> 25 μM (Baylor & Hollingworth, 2011). Compuestos como el Fura-2 o el Indo-1, al tener una alta afinidad por el Ca2+ (Kd en el orden nM) y una baja tasa de separación del Ca2+ presentan limitaciones para seguir en forma confiable la cinética rápida de los movimientos de Ca2+ dentro  de  la  célula  muscular  durante  la  contracción  (Delbono  &  Stefani,  1993;  Hollingworth, Gee & Baylor, 2009). Algunos compuestos como el Mag-Fura-2 y el Mag-Fluo-4 tienen menores afinidades por el Ca2+ (Kd en el orden µM) y generan señales  mucho  más  rápidas;  sin  embargo,  el  Mag-Fura-2 es técnicamente más difícil de usar y tiene una menor eficiencia cuántica cuando se une al Ca2+ en comparación con el Mag-Fluo-4 (Hollingworth, Gee & Baylor, 2009;  Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). Por estas razones, varios grupos, incluido el nuestro, han propuesto que el Mag-Fluo-4 es un buen indicador para estudiar la cinética del Ca2+ dentro de las células musculares (Fig. 1) (Capote et al. 2005; Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a; 2011; 2014). 13 Figura 1. Comparación de la cinética de transitorios de fluorescencia de Ca2+ de una sacudida simple obtenidos en varias células musculares de ratón adulto cargadas con diferentes indicadores fluorescentes (Fura-2, Fluo-3, Fluo-4, Mag-Fluo-4). El más rápido y que mejor sigue la cinética del Ca2+ intracelular es el Mag-Fluo-4 y el que peor lo hace es el Fura-2. (Tomada de Calderón, Bolaños & Caputo, 2014, Fig 1.) Durante  los  últimos  años,  se  ha  empleado  Mag-Fluo-4  para  estudiar  el  Ca2+  citoplasmático muscular bajo diferentes condiciones experimentales en células del  músculo flexor digitorum brevis (FDB) (Caputo, Bolaños & González, 2004; Capote  et al. 2005; Calderón et al. 2009; Calderón, Bolaños & Caputo, 2011; Wei-LaPierre  et  al.  2013;  Calderón,  Bolaños  &  Caputo,  2014;  López  et  al.  2015).  Con  este  compuesto y utilizando células musculares aisladas de ratón, se demostraron los  cambios  que  presentan  los  transitorios  de  fluorescencia  de  Ca2+  durante  el  desarrollo  muscular  (Capote et  al.  2005),  las  diferencias  cinéticas  entre  tipos  de  fibras  (Calderón  et  al.  2009;  Calderón,  Bolaños  &  Caputo,  2010a;  2014)  y  las  modificaciones que sufren durante  la  fatiga (Calderón, Bolaños & Caputo, 2011).  Además,  se  demostró  que  los  mecanismos  de  liberación  y  recaptura  de  Ca2+  tienen  un  papel  diferente  en  cada  tipo  de  fibra  (Calderón,  Bolaños  &  Caputo,  2010b;  2014).  Sin  embargo,  en  los  trabajos  anteriormente  mencionados  las  14 señales obtenidas, que reflejan Ca2+, se han mostrado como relaciones entre la fluorescencia basal (Fbasal) y la fluorescencia pico alcanzada durante la estimulación de las células y no como concentraciones de Ca2+. Las señales de Ca2+ provenientes de indicadores no-relaciométricos como el Mag- Fluo-4 se pueden calibrar y expresar en términos de concentraciones de Ca2+ empleando la ecuación propuesta originalmente por Grynkiewicz, Poenie & Tsien en 1985: [Ca��] = K� (���� ��) (�� á���) Ecuación 1 donde se tiene en cuenta la Kd del indicador por el Ca2+ y los valores de Ca2+ medidos experimentalmente a partir de las señales de fluorescencia: fluorescencia experimental (F), fluorescencia mínima del indicador (Fmin) y fluorescencia máxima del indicador (Fmáx). La kd de los indicadores fluorescentes reportada por los fabricantes se determina generalmente in vitro en ausencia de Mg2+, en solución salina entre 0,1-0,2 M, a una temperatura entre 16-22 °C y a un pH de ~7 (Baylor & Hollingworth, 2011). Pero esta determinación no tiene en cuenta otros elementos presentes en citoplasma que pueden alterar la afinidad del indicador por el Ca2+ como: la fuerza iónica, el efecto del pH, la viscosidad, la presencia de lípidos y proteínas intracelulares. Utilizar parámetros determinados in vitro en la calibración de señales de Ca2+ puede ocasionar estimaciones inexactas, probablemente 15 subestimando la concentración de Ca2+ intracelular (Petr & Wurster, 1997). Para el Mag-Fluo-4 no se ha determinado in situ la Kd, la Fmin y la Fmáx. Por lo tanto, el objetivo principal de este trabajo es determinar in situ los parámetros que permitan calibrar las señales de fluorescencia obtenidas con Mag- Fluo-4 a valores de Ca2+ intracelular en músculo FDB, para finalmente expresar las señales de fluorescencia de los registros de transitorios de fluorescencia de Ca2+ como concentraciones de Ca2+. La estimación in situ de los parámetros mencionados anteriormente del Mag-Fluo- 4 posibilitará que señales obtenidas en términos de cambios de fluorescencia se conviertan a concentraciones de Ca2+ intracelular, lo que permitirá dar respuesta a algunas preguntas importantes en el área que permanecen sin respuesta, como: ¿cuál es la diferencia de la liberación de Ca2+ que hay entre los tipos de fibras?, ¿cuáles son los cambios cuantitativos que hay cuando las fibras se fatigan?, ¿cómo podemos cuantificar el efecto de algunos potenciadores sobre la liberación de Ca2+ dentro de las células? (Calderón, Bolaños & Caputo, 2014). Materiales y métodos Animales y aspectos éticos Se emplearon un total de 16 ratones (14 machos y 2 hembras) adultos de la cepa C57BL/6J, con una edad de 72±13 días y un peso de 24,2±2,9 g. Los animales tuvieron ciclos de luz-oscuridad de 12-12 horas con libre acceso a agua y comida en las instalaciones del bioterio de la Sede de Investigación Universitaria (SIU)- Universidad de Antioquia. Los procedimientos realizados en ratones en el 16 desarrollo de este trabajo fueron aprobados por el Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia. Soluciones y reactivos Para la disección, disociación enzimática y lavados se utilizó Tyrode 2 mM de Ca2+: 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucosa, 10 mM Hepes, 0,33 mM NaH2PO4, pH 7,3. Para la disociación enzimática se utilizó solución de disociación 1 mM de Ca2+: 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 1,2 mM KH2PO4, 0,1 mM Na2HPO4, pH 7,3 y Colagenasa tipo 2 (LS004176 lote F7S17990B, Worthington). En los ensayos de fluorescencia se utilizó 6 μM de Mag-Fluo-4, AM (M14206 lote 10811211, Thermo Fisher Scientific) a partir de un stock a 4 mM de Mag-Fluo-4, AM diluido en DMSO (D231 lote 0495B49, AMRESCO). Durante los ensayos de Fmin, Fmáx y Kd in situ se inhibió la contracción muscular con 50 μM de 4-Metil-N-(Fenilmetil) benzenosulfonamida (BTS) (1870 lote 1A/211388, TOCRIS), un inhibidor selectivo de la actividad ATPasa de la miosina II del músculo esquelético (Cheung et al. 2002), a partir de un stock de 5 mM diluido en DMSO. Se permeabilizó la membrana celular con Saponina al 0,002 % (47036 lote BCBS6399V, Sigma-Aldrich) a partir de un stock de Saponina al 0,1 % diluido en agua destilada o con 40 μM de Ionomicina (I9657 lote 18M4020V, Sigma- Aldrich) a partir de un stock de 5 mM diluido en DMSO y se permeabilizaron membranas subcelulares con Tritón X-100 al 1 % (M143 lote 2062C017, AMRESCO) diluido en agua destilada. Se usó 15 μM de Ácido ciclopiazónico 17 (CPA) (1235/10 lote 8B/213070, TOCRIS) a partir de un stock de 5 mM diluido en DMSO, para inhibir la SERCA (Ljubojevic et al. 2011) e interrumpir el transporte de Ca2+ al RS. Para la calibración in situ se utilizaron soluciones con concentraciones de Ca2+ libre de 100 nM, 1 µM, 4 µM, 40 µM y 100 µM adquiridas del kit CALBUF-2 (lote 6J, WPI, USA). En el desarrollo de los experimentos se prepararon soluciones de Tyrode con concentraciones conocidas de Ca2+ libre de 0 mM, 1 mM, 10 mM, 50 mM y 100 mM sin Mg2+, siguiendo el procedimiento descrito por Bers, Patton & Nuccitelli en 2010 utilizando el programa MaxChelator (http://maxchelator.stanford.edu/) (Tabla 2) y agua ultrapura tipo I (Direct-Q 3, Merck). Tabla 2. Composición de las soluciones con concentraciones conocidas de Ca2+ libre utilizando el programa MaxChelator. Nombre de la solución [EGTA] (mM) [Ca2+] total (mM) [Ca2+] libre (mM) pH Tyrode 0 mM de Ca2+ libre₮ 10 0,1* 9,696-10 7,3 Tyrode 1 mM de Ca2+ libre† 10 10,99 1 7,3 Tyrode 10 mM de Ca2+ libre† 10 20 10 7,3 Tyrode 50 mM de Ca2+ libre‡ 10 60,01 50 7,3 Tyrode 100 mM de Ca2+ libre‡ 10 110,01 100 7,3 ₮ Solución utilizada para hallar la Fmin y compartimentalización del indicador. †Solución utilizada para establecer la Kd. ‡Solución utilizada para determinar la Fmáx. *Concentración aproximada de Ca2+ en el agua ultrapura estimada al comparar la señal de fluorescencia emitida por el Mag-Fluo-4 en el agua ultrapura con los valores de la curva de calibración. 18 Procedimientos experimentales Disociación enzimática Para la separación de las células se empleó el método de disociación enzimática descrito por Bekoff & Betz en 1977, modificado por Capote et al. en 2005 y Calderón et al. en 2009. El músculo entero se incubó en solución de disociación con 3 mg/mL de Colagenasa tipo 2 a 37 °C por 82 min, después de este procedimiento el músculo se lavó tres veces con solución de Tyrode 2 mM de Ca2+ y se resuspendió en 3 mL de la misma solución. Finalmente, se separaron las células musculares de los tendones y restos de tejido conectivo aspirando y soltando suavemente el músculo 45 veces con ayuda de pipetas Pasteur de vidrio pulidas al fuego con diferentes diámetros. La determinación de la obtención de células vivas se realizó mediante la evaluación de la viabilidad celular por medio de tres técnicas: i) Visualización de las características morfológicas por microscopía, ii) Contracción frente a estímulos eléctricos de 20 voltios con duración de 1 ms y una frecuencia de 0,25 Hz utilizando un estimulador eléctrico GRASS instruments S6, y iii) Registro de transitorios de fluorescencia de Ca2+. La suspensión de células se almacenó a 4 °C y los experimentos se llevaron a cabo en las 18 primeras horas después de la muerte del animal, durante este tiempo las células permanecían excitables y se contraían fuertemente (Calderón, Bolaños & Caputo, 2011). 19 Visualización por microscopía y adquisición de las señales de fluorescencia Las imágenes de microscopía en campo claro y fluorescencia se obtuvieron por medio de un microscopio invertido (Axio Observer A1, Carl Zeiss, Alemania), usando una cámara digital (AxioCam ERc 5s, Carl Zeiss, Alemania). La adquisición de las señales de fluorescencia se realizó iluminando las células con una lámpara de Mercurio (HXP 120V, Carl Zeiss, Alemania) o un bombillo LED, la longitud de onda para estimular el Mag-Fluo-4 se seleccionó empleando un juego de filtros (09 488009-9901, Carl Zeiss, Alemania) para excitar el indicador entre 450 y 490 nm y recoger la emisión superior a 515 nm. Las señales luminosas provenientes de las células se colectaron con un fotomultiplicador (Fotómetro PTI D-104 y fotomultiplicador 710, Horiba, Japón). La salida del fotomultiplicador se llevó a un convertidor analógico-digital (Digidata 1550A, Molecular Devices, USA). Todo el sistema se controló a través del software pCLAMP 10.0.5 (Molecular Devices, USA). La amplitud de las señales de fluorescencia (∆F) crudas se reportaron como el cambio de la fluorescencia sobre la fluorescencia basal (Fbasal) en unidades arbitrarias de fluorescencia (U.A.). Carga de las células con el indicador fluorescente de Ca2+, determinación de la fluorescencia basal (Fbasal) y autofluorescencia Los experimentos se realizaron sembrando la solución de células disociadas en una cámara de perfusión (RC-27NE2, Warner Instruments, USA). Para el montaje se añadió etanol al 70 % a una placa cubreobjetos de 24x50 mm y se limpió con una servilleta de papel realizando fricción, evaporando el alcohol y generando una 20 atracción electrostática que permitió la adherencia de las células a la placa. Se agregó vaselina a la cámara de perfusión en los 4 extremos de la cara inferior y se unió dicha cara con la placa cubreobjetos; esto se hizo para que las dos superficies quedaran bien unidas y no se presentaran fugas de la solución. Se acopló la cámara de perfusión en la plataforma (PH 6, Warner Instruments, USA) y se adicionó 400 µL de la solución de células disociadas. La preparación completa se montó sobre la platina del microscopio invertido. En cada uno de los experimentos se observó el montaje en campo claro por microscopia y se escogió una célula morfológicamente intacta y que presentara contracción fuerte frente a estímulos eléctricos. Las células se cargaron utilizando una concentración final de Mag-Fluo-4, AM de 6 µM en Tyrode 2 mM de Ca2+. El indicador se dejó actuar por 10 min a temperatura ambiente en oscuridad. Para los experimentos de Fmáx se lavaron las células 10 veces retirando por un extremo de la cámara experimental 250 µL de la solución y adicionando 250 µL de Tyrode 2 mM de Ca2+ por otro extremo. En los experimentos de Fmin y determinación de la Kd los lavados se realizaron con Tyrode 0,1 mM de Ca2+. Después se dejó el montaje en reposo por 10 min para que el indicador se terminara de desesterificar y se estabilizara la Fbasal, se escogió una región rectangular de interés de la célula de aproximadamente 55x15 μm2, siendo el eje mayor del rectángulo perpendicular al eje longitudinal de la célula. Se visualizó la fluorescencia por medio del fotomultiplicador acoplado a un puerto lateral del microscopio, la señal de fluorescencia de esta región era de 21 aproximadamente 10 U.A. en una escala de 0 a 200 U.A. La señal de fluorescencia obtenida corresponde a la emitida por el Ca2+ basal (Fbasal). Se agregó 50 μM de BTS y se verificó la inhibición de la contracción frente al estímulo eléctrico para continuar los experimentos. Este es el punto de partida para la medición de los transitorios de fluorescencia de Ca2+, compartimentalización del indicador, determinación de la Kd, la Fmin y la Fmáx. (Fig. 2). Para determinar la autofluorescencia de las células se escogió una región de interés de aproximadamente 55x15 μm2 en células sin cargar con el indicador fluorescente, se estimuló la célula con la lámpara de fluorescencia y se registró con el fotomultiplicador la señal de fluorescencia. Los valores de la Kd, la Fmin y la Fmáx obtenidos se corrigieron restando este valor. Medición de transitorios de fluorescencia de Ca2+. Las células musculares vivas tienen la propiedad de cambiar la concentración citoplasmática de Ca2+ libre luego de diversos estímulos, generando señales que se pueden documentar en función del tiempo; el registro que se genera se conoce  como transitorio de fluorescencia de Ca2+ (Calderón & Figueroa, 2009). Para obtener los transitorios de fluorescencia de Ca2+, una vez visualizada la Fbasal, la célula se estimuló eléctricamente con 20 voltios, 1 ms de duración y una frecuencia de 0,25 Hz a través de electrodos que corren paralelamente a lo largo de la cámara de perfusión y se registró el curso temporal de la señal de fluorescencia con el fotomultiplicador. 22  4X 6 µM de Mag-Fluo-4, AM en Tyrode 2 mM de Ca 2+ , T° Amb por 10 min Registro por Fotomultiplicador Fluorescencia del Ca 2+ basal (Fbasal) Registro de la Fmin, Kd y Fmáx, 20 °C Aprobación del Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia. Transitorios de fluorescencia de Ca 2+ Figura 2. Diseño experimental 23 Utilizamos el software Clampfit 10.5.0.9 (Molecular Devices, USA) para determinar los parámetros cinéticos de los transitorios de Ca2+. Para cada registro tomamos la Fbasal como línea de base, seleccionamos un transitorio representativo y por medio de la herramienta estadística hallamos la amplitud del pico (ΔF), tiempo de ascenso, el ancho medio y el tiempo de decaimiento. Posteriormente realizamos un ajuste con una función exponencial doble de la forma: y=A1.e�− (x − x�)/t�� +A2.e�− (x − x�)/t�� +C Donde y representa el valor de la fluorescencia, x el tiempo, y t1 y t2 las constantes de tiempo de caída (ms) de la fase rápida (A1) y de la fase lenta (A2), respectivamente. Las amplitudes de estas fases A1 y A2 se reportan en porcentajes, asumiendo que ΔF representa el 100% de la señal. Determinación de la Fmin y compartimentalización del indicador Una vez registrados los transitorios de fluorescencia de Ca2+ el montaje se llevó a una temperatura de 20 °C y las células se lavaron 10 veces retirando por un extremo de la cámara experimental 200 µL de la solución y adicionando por el otro 200 µL solución de Tyrode 0 mM de Ca2+ libre, finalizando con una solución Tyrode 0 mM de Ca2+ libre con Saponina al 0,002 %, 15 µM de CPA y 50 μM de BTS. Se registró el cambio en la intensidad de la señal de fluorescencia en el tiempo con el fotomultiplicador. La mínima señal adquirida correspondió a la Fmin. Para verificar si hubo compartimentalización del indicador, una vez obtenida la Fmin se agregó Tritón X-100 al 1 % para permeabilizar membranas intracelulares y liberar el indicador que se compartimentalizó, se registró con el fotomultiplicador el 24 cambio en la señal de fluorescencia en el tiempo. El porcentaje de compartimentalización del indicador se obtuvo multiplicando por 100 la señal obtenida después del estímulo con Tritón X-100 al 1 %, dividido por la señal de la fluorescencia basal corregida. Determinación de la Kd Los valores para determinar la Kd se obtuvieron al adquirir por medio del fotomultiplicador la máxima señal de fluorescencia del indicador en presencia de soluciones con concentraciones de Ca2+ libre conocidas a una temperatura de 20 °C. Una vez se obtuvieron los transitorios de fluorescencia de Ca2+ se cambiaron los 400 µL de solución de la cámara de perfusión con Tyrode 0,1 mM de Ca2+ por la solución calibradora realizando 8 lavados, retirando por un extremo de la cámara experimental 200 µL de la solución y adicionando por el otro 200 µL de la solución calibradora de Ca2+. Al final de este recambio, se adicionaron 15 µM de CPA y 50 μM de BTS disueltos en 200 µL de la solución calibradora y se dejó en reposo por 10 min. Después se agregó a la cámara de perfusión 200 µL de la solución calibradora de Ca2+ con Saponina al 0,002 %, 15 µM de CPA y 50 μM de BTS, se registró el cambio de la señal de la fluorescencia en el tiempo por medio del fotomultiplicador. La señal de fluorescencia del indicador correspondiente a la concentración de Ca2+ libre conocida se estableció como el pico máximo de la señal menos la autofluorescencia. Se graficaron los valores máximos de las señales de fluorescencia corregidos por la autofluorescencia en función del pCa2+ de las 25 diferentes soluciones calibradoras, incluyendo los resultados de la Fmin y la Fmáx, se hizo un ajuste de Boltzmann y a partir del parámetro x0 se calculó la Kd (Fig. 7B). Determinación de la Fmáx La Fmáx del indicador se obtuvo adicionando 50 μM de BTS en solución de Tyrode 2 mM de Ca2+ a las células cargadas con el indicador, a una temperatura de 20 °C. Se dejó en reposo por 10 min y se agregó solución de Tyrode 100 mM de Ca2+ libre con Saponina al 0,002 % y 50 μM de BTS o Tyrode 100 mM de Ca2+ libre, 40 μM de Ionomicina y 50 μM de BTS. Se registró la señal de fluorescencia obtenida por el fotomultiplicador. El punto máximo de la señal de fluorescencia después del estímulo menos la autofluorescencia se consideró como la Fmáx corregida del indicador. Se realizó un ensayo previo para asegurar que la señal de fluorescencia obtenida correspondía a la señal del indicador en condiciones saturantes de Ca2+, adicionando a las células cargadas con el indicador Tyrode 50 mM de Ca2+ libre o Tyrode 100 mM de Ca2+ libre con Saponina al 0,002 %. En este ensayo se utilizaron los dos niveles mínimos de excitación de la lámpara de fluorescencia (Nivel 1 y Nivel 2) para determinar si la intensidad de la lámpara tiene algún efecto sobre la adquisición de las señales. Las señales se registraron mediante imágenes tomadas con una cámara acoplada al microscopio de fluorescencia. Mediante el software ImageJ 1.51j8 (Instituto Nacional de Salud, USA), separamos las imágenes fotográficas en RGB, seleccionamos en el canal verde un área de 15x15 μm2 de la célula y otra área del fondo con la misma medida y 26 determinamos utilizando la herramienta Analizar - medida, los valores promedios de la densidad integrada (DI) de la célula y del ruido de fondo (R) en unidades arbitrarias de fluorescencia (U.A.i), con estos valores hallamos la densidad integrada corregida (DIC) de las células mediante la ecuación: DIC = DI – (Área x R) Ecuación 2 Para verificar el cambio que sufrió la célula en presencia de altas concentraciones de Ca2+ se analizó la longitud de la célula antes y después del estímulo de Fmáx mediante imágenes en campo claro utilizando el software ImageJ 1.51j8. Calibración de los transitorios de fluorescencia en términos de concentración de Ca2+ Para expresar los transitorios de fluorescencia en términos de concentración de Ca2+ reemplazamos en la ecuación de Grynkiewicz, Poenie & Tsien (ecuación 1) el valor de la fluorescencia obtenida en U.A. y los valores determinados experimentalmente de la Fmin, la Fmáx y la Kd. corregidos por la autofluorescencia. Realizamos un análisis matemático para determinar en los registros de la Fbasal qué porcentaje de la amplitud corresponde al indicador unido al Ca2+ y al Mg2+. Las reacciones del indicador Mag-Fluo-4 con el Ca2+ y con el Mg2+ son descritas como las siguientes reacciones reversibles: Ca�� + I ��, ���� �������� Ca�� I Mg�� + I ��, � ��� �������� Mg�� I 27 donde I representa el indicador fluorescente y Kd, Ca2+ y Kd, Mg2+ son las constantes de disociación de Ca2+ y de Mg2+ respectivamente. Por la definición de la constante de disociación tenemos que: K�, Ca�� = [��] [ �� �� ] [ �� �� �] Ecuación 3.1 K�, Mg�� = [��] [ � � �� ] [ � � �� �] Ecuación 3.2 donde [Ca2+I] y [Mg2+I] son las concentraciones de Ca2+ y de Mg2+ unidas al indicador en estado de equilibrio, y [IL] es la concentración del indicador libre, también en estado de equilibrio. Además, definimos [IT] como la concentración total de indicador, que puede estar unido al Ca2+, unido al Mg2+ y libre, �I��= I� + �Ca �� I�+ �Mg ��I� Ecuación 3.3 Al despejar [IL], [Ca2+I] + [Mg2+I] del sistema de ecuaciones 3.1, 3.2 y 3.3, obtenemos que: [I�] = ������,� ��� ��,���� ���� �� ]��,� ��� ��(��,���� ��,� ��� ��(��,���� [� � �� ]) Ecuación 3.4 [Ca��I] = [���� ]������,� ��� ���� �� ]��,� ��� ��(��,���� ��,� ��� ��(��,���� [� � �� ]) Ecuación 3.5 y [Mg��I] = ������,���� [� ��� ] ���� �� ]��,� ��� ��(��,���� ��,� ��� ��(��,���� [� � �� ]) Ecuación 3.6 28 Obtención de los datos y estadística Los registros de fluorescencia obtenidos con el fotomultiplicador se analizaron con el programa Clampfit 10.5.0.9 (Molecular Devices, USA). En general, a todos se les aplicó un filtro de paso bajo tipo gaussiano de 1000 Hz. Posteriormente se corrigió el registro restando la amplitud promedio calculada en una región de 1,5 s obtenida con la luz LED apagada. La Fbasal se calculó en una región de 5 s obtenida después de hacer incidir la luz sobre la célula. Para los diferentes experimentos (Fmin, Fmáx y Kd) el valor de la máxima amplitud se obtuvo al promediar una región de 0,5 s justo en el pico del registro. El abordaje de promediar regiones al analizar un registro es más preciso que tomar un valor puntual, porque reduce el impacto de las oscilaciones en el ruido sobre el valor medido. Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPadPrism 6.01 (GraphPad, USA) y Origin Pro 2015 (OriginLab, USA), los valores se muestran como media±DE. Para establecer diferencias entre dos conjuntos de datos empleamos la prueba t de Student y más de dos conjuntos de datos empleamos la prueba ANOVA con prueba post-hoc de Tukey. Se consideraron significativos cuando P<0,05. 29 Resultados Obtención de las células musculares y evaluación de la viabilidad celular Logramos  realizar  la disección del músculo FDB entero, sin  tejidos de músculos  adyacentes y sin daños mecánicos en un  tiempo post-sacrificio del  ratón de 9±3  min  y  18±5  min,  para  los  músculos  de  las  extremidades  posteriores  1  y  2,  respectivamente, obteniendo una buena cantidad de células vivas en suspensión  que preservaron las características morfológicas del tejido (Fig. 3). . Figura 3. Características morfológicas de viabilidad celular. (A) Célula en Contraste de Interferencia Diferencial viva, completa, alargada, con membrana definida (flecha negra) con estriaciones transversales producto de la organización de los filamentos delgados y gruesos (flecha azul) y múltiples núcleos periféricos (flechas rojas). (B) Célula en campo claro muerta o deteriorada con obvias alteraciones estructurales. Las  células  de  interés  sometidas  a  estimulación  eléctrica  conservaron  la  capacidad  de  contraerse  fuertemente  (resultados  no  mostrados)  y  posterior  a  la  50 μm 50 μm A B 30 carga con el indicador Mag-Fluo-4, AM generaron transitorios de fluorescencia de Ca2+ (ver adelante). Estos resultados en conjunto demuestran la viabilidad de las células musculares obtenidas en la suspensión Carga de las células con el indicador fluorescente de Ca2+, determinación de la Fbasal y autofluorescencia Las células no cargadas con el indicador Mag-Fluo-4, AM al ser excitadas emitieron una fluorescencia verde tenue, lo que facilitó la ubicación de la región de interés. El valor de la fluorescencia registrado en la región de interés por el fotomultiplicador correspondiente a la autofluorescencia fue de 0,046±0,013 U.A. (n=6). Las células cargadas con 6 µM Mag-Fluo-4, AM por 10 min exhibieron buen ingreso y una distribución uniforme del indicador en su citoplasma. Al visualizar las células en campo claro después de la carga se observaba cómo el citoplasma se tornaba naranja (color del indicador) (Fig. 4B) y al excitar las células se apreciaba la emisión en verde solo en el interior de las células (Fig. 4C). La Fbasal de las células utilizadas en todos los experimentos realizados fue de 9,986±0,421 U.A y la Fbasal corregida fue de 9,940±0,421 U.A. (n=63). Medición de transitorios de fluorescencia de Ca2+ En la evaluación de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ se determinaron los cambios en la concentración de Ca2+ citoplasmático mediante el registro de la señal de fluorescencia emitida por el indicador Mag-Fluo-4 en el tiempo, como respuesta al estímulo eléctrico. Las células no perdieron adherencia por la 31 contracción  generada  frente  el  estímulo  eléctrico,  ni  durante  los  lavados  de  los  diferentes experimentos. Se  determinaron  los  parámetros  cinéticos  de  los  transitorios  de  fluorescencia  de  Ca2+ obtenidos (n=14) (Fig. 5) a partir de una F basal corregida  de 10,387±0,487 U.A. Figura 4. Carga de las células con 6 µM del indicador fluorescente Mag-Fluo-4, AM. (A) Célula en campo claro antes de la carga con el indicador. (B) Célula en campo claro después de la carga con el indicador. (C) Fluorescencia del indicador correspondiente al Ca2+ basal. A B C 50 μm 50 μm 50 μm 32 Figura 5. Morfología y parámetros cinéticos de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ de músculo FDB de ratón. (A) Transitorio de fluorescencia de Ca2+ de una sacudida simple con los valores de los parámetros cinéticos característicos del transitorio de fluorescencia. (B) Promedio de los parámetros cinéticos de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ (n=14). Los valores se muestran como media±DE. Determinación de la Fmin y compartimentalización del indicador En los experimentos para determinar la Fmin y compartimentalización del indicador (n=10) se partió de una Fbasal corregida de 10,15±0,58 U.A. Al adicionar el estímulo de Tyrode 0 mM de Ca2+ libre + Saponina al 0,002 % la intensidad de la señal de fluorescencia decayó, estabilizándose posteriormente, tomamos estos valores y los corregimos por la autofluorescencia, dando como resultado una Fmin corregida de 0,14±0,1 U.A. Al agregar posteriormente Tritón X-100 al 1 %, la señal decayó nuevamente estabilizándose en 0,11±0,07 U.A., lo que representa una compartimentalización del 1,1±0,7 % del Mag-Fluo-4 (Fig. 6). Parámetro Valor ∆F 8,864±3,926 U.A Tiempo de ascenso 0,95±0,218 ms Ancho medio 4,72±2,11 ms Tiempo de decaimiento 39,45±24,49 ms Tau 1 2,70±1,57 ms Tau 2 28,12±21,54 ms A1 52±12 % A2 48±12 % Tiempo de ascenso del 10 % al 90 % de la amplitud del transitorio: 0,9 ms Ancho en el 50 % de la amplitud del transitorio: 3,44 ms 70 ms 0,2 U.A. Δ F/F basal Tau 1: 4,9 ms Tau 2: 13,23 ms A B 33 Figura 6. Registro por fotomultiplicador de la Fmin y compartimentalización del indicador Mag-Fluo-4 acompañado de imágenes obtenidas por cámara acoplada al microscopio. Flecha verde: Adición de Tyrode 0 mM de Ca 2+ libre + Saponina al 0,002 % con 50 µM de BTS y 15 µM de CPA. Flecha azul: Adición de Tritón X-100 al 1 %. Flecha roja solida: Registro de la fluorescencia de fondo. Flecha roja punteada: Registro de la señal con la fuente de luz apagada. Flecha contorno rojo: Registro de la señal con el puerto del fotomultiplicador cerrado. 1 2 3 4 In te ns id ad  d e  la  s eñ al  (U .A .)  0 2 4 6 8 10 2 Tiempo (min)  30 s 0,003 U.A. 1:47 min 9,774 U.A. 2:30 min 3,153 U.A. 5:00 min 0,398 U.A. 4 6 8 10 12 50 µm 50 µm 50 µm 50 µm Tyrode 0 mM de Ca 2+ libre + Saponina al 0,002 % Tritón X-100 al 1 % 34 Determinación de la Kd Después de registrar los transitorios de fluorescencia de Ca2+ y adicionar los 15 µM de CPA + 50 μM de BTS disueltos en 200 µL de la solución calibradora las células de interés dejaban de contraerse, pero seguían generando transitorios de fluorescencia de Ca2+ con una menor amplitud. Adquirimos por medio del fotomultiplicador los registros de las señales de fluorescencia del indicador en presencia de las diferentes soluciones calibradoras con concentraciones conocidas de Ca2+ libre, partiendo de una Fbasal corregida de 9,76±0,28 U.A (n=29). Después del estímulo con la solución calibradora las señales de fluorescencia presentaron un incremento de la señal con respecto a la Fbasal (Fig. 7A), únicamente en los registros con la solución calibradora de 100 nM las señales disminuyeron con respecto a la Fbasal. Observamos que después de estimular las células con las soluciones calibradoras de Ca2+ libre con 1 μM (n=5), 4 μM (n=4) o 40 μM (n=3), la señal registrada decaía con respecto a la Fbasal en 2,616±0,803 U.A., 1,749±0,196 U.A. y 1,992±1,510 U.A., respectivamente, seguido de un incremento de la señal (Fig. 7A). En promedio la señal de la Fbasal decayó (n=12) de 9,666±0,3 U.A. a 7,494±0,831 U.A., lo que representa una disminución de 22,47 % en la señal. En tres de los registros en los que se estimularon las células con la solución calibradora con 1 mM de Ca2+ libre observamos que luego de adicionar los 15 µM de CPA + 50 μM de BTS obtuvimos un pico en la señal con una amplitud de 7,863±3,224 U.A. con respecto a la Fbasal, señal que posteriormente decayó hasta 35 la Fbasal. Realizamos un experimento estimulando la célula con la solución calibradora con 10 mM Ca2+ y adicionamos primero los 50 μM de BTS y 5 min después los 15 µM de CPA obteniendo un pico en la señal con una amplitud de 10,089 U.A. con respecto a la Fbasal. El pico solo se presentó después de que adicionamos los 15 µM de CPA. Graficamos los valores máximos promedio de las señales después del estímulo para cada una de las concentraciones de Ca2+ libre conocidas, corregidos por la autofluorescencia (Tabla 3) en función del pCa2+, realizamos un ajuste de Boltzmann y determinamos que la Kd in situ del indicador Mag-Fluo-4 en células del músculo FDB de ratón es 118,9 µM (Fig. 7B). Tabla 3. Valores máximos promedio de las señales después del estímulo para cada una de las concentraciones de Ca2+ libre conocidas [Ca2+] libre n Valores máximos corregidos en U.A. (media±DE) 100 nM 5 0,127±0,048 1 μM 5 19,890±2,624 4 μM 4 20,731±1,501 40 μM 3 51,64±4,964 100 μM 2 55,412±10,259 1 mM 5 69,365±8,438 10 mM 5 123,539±18,583 36 Figura 7. Determinación de la Kd del indicador Mag-Fluo-4. (A) Registro del cambio de la señal de fluorescencia del indicador Mag-Fluo-4 en el tiempo en presencia de tres diferentes soluciones calibradoras de Ca2+ + Saponina 0,002 % (Flecha verde). (B) Kd estimada mediante la ecuación de Boltzmann (descrita en B, panel derecho) a partir de los valores máximos de las señales de fluorescencia corregidos por la autofluorescencia en función del pCa2+. Kd: 118,9 µM  In te ns id ad d e la s eñ al (U .A .) Tiempo (s) 150 0 20 40 60 80 100 120 140 160 50 100 150 200 20015010050 Tiempo (min) 2 10 12 3 11 1 14 10 mM de Ca 2+   0 20 40 60 80 100 120 140 160 In te ns id ad d e la s eñ al (U .A .) 50 100 200 Tiempo (s) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 160 4 µM de Ca 2+  libre In te ns id ad d e la s eñ al (U .A .) A 1 mM de Ca 2+   160 100 120 140 40 60 80 0 20 In te ns id ad d e la s eñ al (U .A .) -8 -6 -10 -2 -12 -4 0 pCa 2+ B 37 Determinación de la Fmáx En el ensayo previo para asegurar que la señal de fluorescencia obtenida en los experimentos correspondía a la señal del indicador en condiciones saturantes de Ca2+, determinamos que no hay diferencias estadísticamente significativas entre las DIC al estimular con Tyrode 50 mM de Ca2+ libre o Tyrode 100 mM de Ca2+ libre con Saponina al 0,002 %, sin importar el nivel de excitación de la lámpara de fluorescencia utilizado. Tampoco encontramos diferencias significativas entre las Fbasal Nivel 1 y Nivel 2 pero sí con las demás variables evaluadas (Fig. 8). Figura 8. Análisis de la densidad integrada corregida (DIC) a concentraciones saturantes de Ca2+. Las DIC de la Fbasal Nivel 1 (68,97±14,48 U.A.i, n=18) y Nivel 2 (98,13±19,34 U.A.i, n=18) no fueron significativamente diferentes entre ellas, pero sí presentaron diferencias con las demás variables evaluadas. No se encontraron diferencias significativas entre la Fmáx a 50 mM de Ca2+ Nivel 1 (171,8±38,1 U.A.i, n=9) y Nivel 2 (189,7±12,45 U.A.i, n=9), la Fmáx a 100 mM de Ca2+ Nivel 1 (180,51±42,07 U.A.i, n=9) y Nivel 2 (188,9±21,07 U.A.i, n=9) (P>0,05). Los valores se muestran como media±DE. **P<0,01, ****P<0,0001; ANOVA con prueba post-hoc de Tukey. Los experimentos en los que estimulamos las células con Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + Saponina al 0,002 % (Fig. 9) presentaron un pico máximo de fluorescencia **** 0 40 80 120 160 200 240 D en si da d in te gr ad a co rr eg id a (U .A .i) Fluorescencia (U.A.i) F basal F máx 50 mM de Ca 2+ F máx 100 mM de Ca 2+ F basal F máx 50 mM de Ca 2+ F máx 100 mM de Ca 2+ Nivel 1 Nivel 2 **** ** ** 38 corregido por la autofluorescencia correspondiente a la Fmáx corregida de 150,889±8,798 U.A. (n=8), a partir de una Fbasal corregida de 9,785±0,448 U.A. Este pico se presentó a los 40,43±14,14 s después de adicionar el estímulo, con un tiempo de ascenso de 4,62±1,988 s (n=7). El ascenso fue constante y limpio, seguido de una caída rápida de la señal. Cuando estimulamos las células con Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + 40 μM de Ionomicina (Fig. 10) obtuvimos un pico máximo de fluorescencia corregido por la autofluorescencia correspondiente a la Fmáx corregida de 102±27,402 U.A. (n=9) a partir de una Fbasal corregida de 10,081±0,286 U.A. Este pico se presentó a los 84,38±18,715 s después de adicionar el estímulo, con un tiempo de ascenso de 26,11±11,018 s (n=8). El pico máximo fue menor (Fig. 11), el ascenso menos constante y la caída más lenta en comparación con los registros en donde se estimuló la célula con Saponina. ***P<0,001; t-test para variables no apareadas. Las células presentaron una longitud antes del estímulo con Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + Saponina al 0,002 % y 50 μM de BTS de 432±41,57 μm y después del estímulo de 313±55,031 μm (n=6), lo que representa una reducción del 28±6 % en la longitud de las células tras el estímulo (Fig. 12). No medimos los cambios en la longitud de las células cuando se estimularon con Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + 40 μM de Ionomicina y 50 μM de BTS, pero observamos un acortamiento similar a los obtenidos cuando estimulamos las células con Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + Saponina al 0,002 % y 50 μM de BTS. Lo que nos hace pensar que la reducción en el tamaño es causada por la alta concentración del Ca2+ y no del ionóforo utilizado. 39 Figura 9. Determinación de la fluorescencia máxima con Saponina. Registro por fotomultiplicador de la Fmáx del indicador Mag- Fluo-4 acompañado de imágenes obtenidas por cámara acoplada al microscopio. Flecha verde: Adición de Tyrode con 100 mM de Ca2+ libre con Saponina al 0,002 % y 50 µM de BTS. 1 2 43 In te ns id ad  d e  la  s eñ al  (U .A .)  0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 -20 100 Tiempo (s)  30 s 9,86 U.A. 49 s 161,12 U.A. 2 min 78,15 U.A. 7,5 min 1,99 U.A. 50 µm 50 µm 50 µm 50 µm 200 300 400 500 Tyrode 100 mM de Ca 2+ libre + Saponina al 0,002 % 40 Figura 10. Determinación de la fluorescencia máxima con Ionomicina. Registro por fotomultiplicador de la Fmáx del indicador Mag-Fluo-4 acompañado de imágenes obtenidas por cámara acoplada al microscopio. Flecha verde: Adición de Tyrode con 100 mM Ca 2+ libre con 40 µM de Ionomicina y 50 µM de BTS. 1 2 3 In te ns id ad  d e  la  s eñ al  (U .A .)  0 20 40 60 80 100 Tiempo (s)  10 s 10,5 U.A. 1:40 min 93,3 U.A. 6:40 min 34,5 U.A. 50 µm 200 300 400 500 Tyrode 100 mM de Ca 2+ libre + 40 µM de Ionomicina 50 µm 50 µm 50 µm 41   Figura 11. Comparación de las Fmáx corregidas. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las Fmáx corregidas cuando las células se estimularon con Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + Saponina al 0.002 % (150,889±8,798 U.A., n=8, barra gris) o Tyrode 100 mM de Ca2+ libre + 40 μM de Ionomicina (102±27,402 U.A., n=9, barra negra). Los valores se muestran como media±DE. ***P<0,001; t-test para variables no apareadas. Figura 12. Cambio de la longitud de la célula en la determinación de la Fmáx. (A) Célula en campo claro antes del estímulo con Tyrode con 100 mM de Ca2+ libre, Saponina al 0,002 % y 50 µM de BTS. (B) Célula en campo claro después del estímulo con Tyrode con 100 mM de Ca2+ libre, Saponina al 0,002 % y 50 µM de BTS. Esta célula se acortó un 29 %. 50 μm 50 μm A B 0 40 80 120 160 200 Saponina Ionomicina *** In te ns id ad  d e  la  s eñ al  (U .A .) 42 Calibración de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ en términos de concentración de Ca2+ Para reducir el ruido de la señal, realizamos un promedio de 5 transitorios de fluorescencia de Ca2+, corregimos estos valores por la autofluorescencia y los regraficamos (Fig. 13A), reemplazamos estos valores, la Fmin corregida, la Fmáx corregida y la Kd en la ecuación de Grynkiewicz, Poenie & Tsien (ecuación 1) para determinar cada valor a qué concentración de Ca2+ equivalía y graficamos estos valores en función del tiempo (Fig. 13B). Figura 13. Transitorios de fluorescencia de Ca2+ en términos de concentración de Ca2+. (A) Promedio de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ de una sacudida simple obtenido experimentalmente en términos del cambio en la intensidad de fluorescencia del indicador Mag-Fluo-4 en U.A en el tiempo (n=5). (B) Promedio de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ de una sacudida simple expresado en términos del cambio de la concentración de Ca2+ en el tiempo empleando la ecuación 1 (n=5). Tiempo (ms) In te ns id ad d e la s eñ al (U .A .) 12 14 16 20 22 18 10 0 200 400 600 800 1000 8 10 12 14 16 18 20 C a2+ (µ M ) Tiempo (ms) 0 200 400 600 800 1000 12 14 16 20 18 10 8 A B 43 Establecimos que las células del músculo FDB de ratones adultos de la cepa C57BL/6J (n=14) tienen una concentración de Ca2+ libre basal en el citoplasma de aproximadamente 8,7±0,4 μM y después de un estímulo eléctrico la concentración de Ca2+ libre se puede incrementar hasta 17,37±4,10 μM en el citoplasma, presentando un cambio de 8,67 μM. En el análisis matemático realizado a la Fbasal asumimos que el Mag-Fluo-4 tiene una Kd para Mg2+ de 4,7 mM (reportada por el fabricante in vitro) y una Kd para Ca2+ de 118,9 µM (determinada in situ en nuestros experimentos), concentraciones intracelulares del indicador de 200 µM o 400 µM, 100 nM para el Ca2+ y 1 mM para el Mg2+. Al reemplazar estos valores en las ecuaciones 3.4, 3.5 y 3.6, observamos que del indicador unido a un ion solo el 0,4% (0,069x100/0,069+17,532) está unido al Ca2+ y el 99,6 % restante está unido al Mg2+, independiente de la concentración del indicador total. Si consideramos que la Kd del indicador para el Mg2+ determinada in vitro posiblemente es menor que in situ estaríamos sobre estimando el porcentaje de indicador unido a Mg2+. Si asumimos que al realizar el ajuste con las Kd determinadas in vitro para Ca2+ de 22 µM y para Mg2+ de 4,7 mM introducimos un error proporcional, obtenemos que del indicador unido a un ion el 2,09 % (0,373x100/0,373+17,478) está unido al Ca2+ y el 97,91 % restante está unido al Mg2+, independiente de la concentración del indicador total (Tabla 4). 44 Tabla 4. Indicador libre y unido al Ca2+ y al Mg2+ en estado de reposo para dos concentraciones del indicador. [IT] (µM) Kd Ca2+ (µM) [Ca2+] (µM) [Mg2+] (µM) [ILibre] (µM) [Ca2+I] µM [Mg2+I] µM ILibre (%) Ca2+I (%) Mg2+I (%) 200 118,9 0,1 1000 164,798 0,139 35,063 82,4 0,069 17,532 400 118,9 0,1 1000 329,596 0,277 70,127 82,4 0,069 17,532 200 22 0,1 1000 164,297 0,747 34,957 82,1 0,373 17,478 400 22 0,1 1000 328,593 1,494 69,913 82,1 0,373 17,478 Asumiendo que el Mag-Fluo-4 tiene una Kd in vitro para Mg2+ de 4,7 mM Si el 0,4 % de la Fbasal corregida determinada en los transitorios de fluorescencia de Ca2+ (10,387±0,487 U.A, n=14) corresponde a la fluorescencia emitida por la unión del indicador con el Ca2+, en realidad nuestra Fbasal corregida sería de 0,0415±0,002 U.A. Para asumir condiciones in situ sumamos a este valor la Fmin, obteniendo una señal correspondiente al indicador unido a Ca2+ de 0,185±0,002 U.A. y un pico máximo de 19,25±3,9 U.A. Reemplazamos estos valores en la ecuación de Grynkiewicz, Poenie & Tsien (ecuación 1) y determinamos que los transitorios de fluorescencia tenían una concentración Ca2+ basal ajustada de 30±0,002 nM y un pico en la concentración de Ca2+ tras el estímulo de 17,37±4,10 µM. Si realizamos el mismo procedimiento asumiendo que el 2,09 % de la Fbasal corregida determinada en los transitorios de fluorescencia de Ca2+ (10,387±0,487 U.A, n=14) corresponde a la fluorescencia emitida por la unión del indicador con el Ca2+, obtenemos que Fbasal corregida sería de 0,217±0,010 U.A, asumiendo condiciones in 45 situ sumando la Fmin, obtenemos una señal correspondiente al indicador unido a Ca2+ de 0,360±0,010 U.A. y un pico máximo de 19,25±3,9 U.A. Al reemplazar estos valores en la ecuación de Grynkiewicz, Poenie & Tsien (ecuación 1) determinamos que los transitorios de fluorescencia presentan una concentración Ca2+ basal ajustada de 171±0,008 nM y un pico de 17,37±4,10 µM tras una sacudida simple (n=14). Discusión Obtención de las células musculares y evaluación de la viabilidad celular La obtención de células musculares intactas es una metodología de gran utilidad para la investigación en las áreas de Fisiología y Biofísica muscular. Basados en la técnica de disociación enzimática descrita por Bekoff & Betz en 1977 se han obtenido grandes cantidades de células de diferentes músculos y especies de mamíferos que conservan sus características morfológicas y funcionales (Szentesi et al. 1997; Capote et al. 2005; Caputo, Bolaños & González, 2004; Calderón & Figueroa, 2009; Calderón et al. 2009; Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a; 2011; López et al. 2015; Cully et al. 2016). En investigaciones previas realizadas en el músculo FDB de ratón de la cepa NMRI se reportaron condiciones para la disociación enzimática de 4 mg/mL de colagenasa por 60 min a 36 °C (Capote et al. 2005; Bolaños et al. 2008), de 3 mg/mL de colagenasa entre 52 y 64 min a 36,5 °C (Calderón et al. 2009: Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a; 2011) y en músculo FDB de las cepas de ratones DBA y FVB utilizaron 2 mg/mL de colagenasa durante 3 h a 37 °C. (González, 2004). 46 Observamos que en general en las investigaciones anteriores la concentración de la enzima y el tiempo de incubación fueron menores a los de nuestro estudio, esto se debe posiblemente a que en la cepa C57BL/6J el músculo FDB esté rodeado de una mayor cantidad de tejido conectivo. También es importante considerar la edad de los animales pues la composición en los tipos de células musculares varía según la etapa de la vida. Al momento de nacer las células musculares no se encuentran diferenciadas y durante las primeras semanas de vida ocurren cambios fisiológicos, bioquímicos y morfológicos que permiten alcanzar las propiedades características de los músculos de ratones adultos (Ward & Wareham, 1985). Por ejemplo, en células de FDB de ratones entre 10 y 15 días de edad la fase ascendente de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ tiene un tiempo de ascenso más lento en comparación con la de los adultos (Capote et al. 2005, Calderón et al. 2009). Nosotros empleamos en todos nuestros experimentos ratones con más de 7 semanas para garantizar que las células eran maduras y los transitorios de fluorescencia estables en el tiempo (Capote et al. 2005). Consideramos que en futuras investigaciones en las que se utilice como modelo células del músculo FDB de la cepa de ratón C57BL/6J nuestro protocolo estandarizado de disección y disociación será de gran utilidad para la obtención de una suspensión rica en células viables. Con respecto a la visualización por microscopía óptica en campo claro de las características morfológicas de las células, observamos que aquellas células alargadas, brillantes y con membrana definida conservaban su funcionalidad pues 47 presentaban contracción ante estímulos eléctricos y generaban transitorios de fluorescencia de Ca2+ (resultados que se discutirán más adelante). Es importante destacar que la evaluación de las características morfológicas, la contracción frente a estímulos eléctricos y el registro de transitorios de fluorescencia de Ca2+, demuestran que las células eran fisiológicamente intactas antes de comenzar los procedimientos de calibración. Nuestro modelo experimental se ajusta más a la definición de ex vivo, pero típicamente en el área cuando se han realizado calibraciones de indicadores fluorescentes de Ca2+ dentro de la célula se ha denominado in situ (Petr & Wurster, 1997; Cully et al. 2016; Friedrich & Head, 2017) y cuando se han realizado en cubeta se ha denominado in vitro (Delbono & Stefani, 1993; Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Baylor & Hollingworth, 2011; Cully et al. 2016). Dado su uso extendido y la visibilidad que nos genera en las bases de datos, preferimos seguir utilizando el término in situ. Sin embargo, esperamos incluir este punto en la discusión en una futura publicación. Carga de las células con el indicador fluorescente de Ca2+ y determinación de la autofluorescencia Los indicadores fluorescentes son agentes exógenos que pueden interferir con la función celular, por lo tanto, se debe utilizar la concentración más baja posible (Cobbold & Rink, 1987; Hu, Yu & Yu, 2005). Cuando se utilizan indicadores en la forma AM es difícil conocer la concentración que se alcanza a nivel intracelular, así se conozca la concentración total del indicador adicionada externamente, pues 48 una vez la molécula del indicador está en las células y el grupo éster AM ha sido separado por esterasas intracelulares, representa una molécula diferente atrapada dentro del citosol y las moléculas de indicador desesterificadas se seguirán acumulando (Friedrich & Head, 2017). Investigaciones previas han reportado la carga de las células de FDB de ratones de la cepa NMRI con Mag-Fluo-4, AM a concentraciones de: 10 µM entre 30 y 40 min (Capote et al. 2005; Caputo, Bolaños & González, 2004) y 60 min (Calderón et al. 2009), 8-10 µM entre 35 y 45 min (Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a; 2011, Calderón et al. 2013). También se han cargado células de extensor digitorum longus (EDL) de ratones RAmKO con 10 µM de Mag-Fluo-4, AM entre 10 y 15 min (López et al. 2015). Hasta donde conocemos, hemos utilizado una concentración y tiempo de carga del indicador menor a los reportados en la literatura, obteniendo transitorios de fluorescencia comparables a los publicados previamente (ver adelante). Teniendo en cuenta la Fmáx obtenida, determinamos que bajo nuestras condiciones de carga al registrar los transitorios de fluorescencia de Ca2+ solo utilizamos el 12,5 % de la fluorescencia posible dada por del indicador, por lo que consideramos que se pueden estandarizar condiciones que permitan una menor carga de la célula con el fluoróforo, lo que reducirá el riesgo de presentar alteraciones fisiológicas, disminución en el tiempo de los experimentos y aumento en el rendimiento del reactivo. Si bien no determinamos la concentración intracelular del indicador utilizada en nuestros experimentos, una forma de controlar que la concentración alcanzada 49 intracelularmente en todas las células sea aproximadamente la misma al momento de realizar los experimentos es siendo riguroso con la concentración extracelular utilizada, el tiempo de carga, cantidad de lavados y periodo de tiempo para la experimentación, tal como hicimos en este caso. Además, la baja variabilidad observada en los experimentos de Fmáx sugiere que siempre obteníamos concentraciones de indicador comparables entre las células. En las células hay constituyentes que pueden emitir autofluorescencia como los componentes del tejido conectivo, las fibras de colágeno, las calcificaciones, los nucleótidos de piridina (NADH, NADP), el mononucleótido de flavina (FMN) y el dinucleótido de adenina y flavina (FAD) (Hu, Yu & Yu, 2005). El FAD tiene un pico de excitación de 450 nm y una emisión entre 530 y 550 nm, (Harbig et al. 1976) compartiendo rangos de emisión y excitación con nuestro indicador. Para eliminar la influencia de esos constituyentes sobre nuestras señales, determinamos los valores de autofluorescencia en nuestra preparación y los restamos de todos los registros. En general, el impacto de la autofluorescencia en nuestros experimentos fue mínimo. Por ejemplo, en los registros de la Fbasal la autofluorescencia representó menos del 0,5 %. Petr & Wurster en 1997 corrigieron la autofluorescencia en la calibración in situ del indicador Fura-2 en la línea celular de astrocitos U373-MG, mientras que en los resultados de la calibración in situ del indicador Fluo-4 en cardiomiocitos de rata realizada por Ljubojevc et al. en 2011 no se reportó si este valor se consideró. 50 Caracterización de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ Al analizar los transitorios de fluorescencia obtenidos en esta investigación, observamos que cumplen con las características generales que presenta un transitorio de fluorescencia de Ca2+ de células musculares reportadas en diferentes investigaciones (Delbono & Stefani, 1993; Jacquemond, 1997; Caputo, Bolaños & González, 2004;  Capote et al. 2005;  Calderón et al. 2009; Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a; 2014). Tarpey et al. en 2018 caracterizaron los tipos de fibras que componen el músculo FDB de ratones machos adultos de la cepa C57/BL6, reportando que la totalidad del músculo tiene un 4,4±2,9 % de células tipo I, un 43,9±1,9 % de células tipo IIA y un 51,6±4,8 % de células IIX, estos resultados concuerdan con datos nuestros no publicados donde usamos anticuerpos para clasificar los tipos de fibras del FDB. Al músculo FDB ser heterogéneo en su composición es importante determinar el tipo de fibra utilizada en los experimentos. Calderón et al. en 2009 empleando células musculares de FDB de ratones machos de la cepa NMRI entre 42 y 49 días de edad cargadas con Mag-Fluo-4, AM, clasificaron la morfología de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ en dos tipos: morfología tipo I (MT-I) que incluye las fibras I y IIA, y morfología tipo II (MT-II) que incluye las fibras IIX y IIB. Comparamos los parámetros cinéticos de nuestros transitorios de fluorescencia (Fig. 5B) con los reportados por Calderón et al. en 2009 para cada morfología (Fig. 14), en términos generales, los parámetros cinéticos de nuestros transitorios se asemejan más a los MT II, que, a los MT I, como era de esperarse. Como partimos de valores reportados como media±SEM los datos no pudieron ser sometidos a 51 análisis estadístico. Las pequeñas diferencias observadas entre nuestros datos y las MT II de ratones previamente publicados se podrían explicar posiblemente por tratarse de cepas de ratones diferentes y la diferencia en la edad de estos. Figura 14. Comparación de los parámetros cinéticos de los transitorios de fluorescencia de Ca2+ de músculo FDB de ratón. (A) Variables medidas en porcentaje. (B) Variables relacionadas con la fluorescencia (C) Variables medidas en ms. La barra blanca corresponde a los parámetros obtenidos experimentalmente en este trabajo (M-E, n=14), la barra gris claro corresponde a los parámetros de morfología tipo I (MT-I, n=11) y la barra gris oscuro a los parámetros de la morfología tipo II (MT-II, n=47), estos dos últimos fueron graficados a partir de los datos reportados por Calderón et al. 2009. Los valores se muestran como media±SEM. MT-I MT-II M-E 100 80 60 40 20 0 Am pl itu d (% ) A1 A2 A 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Δ F/ F ba sa l Amplitud B Tiempo de ascenso Ancho medioTiempo de decaimiento Tau 1 Tau 2Tiempo de ascenso Ancho medio Tiempo de decaimiento Tau 1 Tau 2 Ti em po (m s) 50 40 30 20 10 4 2 0 C 52 Los resultados de MT-II son coherentes con la inhibición de la contracción muscular frente a estímulos eléctricos evidenciada en nuestros experimentos cuando las células se incubaron con 50 μM de BTS. El BTS a bajas concentraciones es un inhibidor selectivo de la actividad ATPasa de la miosina II del músculo esquelético, inhibiendo la contracción de las células tipo II, esta propiedad se ha utilizado en otras investigaciones para discriminar los tipos de células (Cheung et al. 2002; Shaw, Ostap & Goldman, 2003; Calderón et al. 2009;  Cully et al. 2016). En conjunto estos resultados nos permiten concluir que los resultados obtenidos en esta investigación corresponden a células musculares tipo IIX. Determinación de la Fmin y compartimentalización del indicador Dado que la Fmin depende de la concentración del indicador utilizada (Olivera & Pizarro, 2018), al no conocerse la concentración del indicador intracelular posterior a la carga con la forma AM, la Fmin debe ser calculada in situ bajo las condiciones experimentales estandarizadas. La determinación de la Fmin mediante la adición de Tyrode 0 mM de Ca2+ libre con Saponina al 0,002 %, 15 µM de CPA y 50 μM de BTS, arrojó resultados reproducibles y confiables. Utilizar el indicador en la forma AM es una técnica no invasiva y sencilla de cargar las células con indicadores fluorescentes. Sin embargo, este método puede presentar algunos problemas como la compartimentalización, que puede introducir importantes fuentes de error en las mediciones. La compartimentalización ocurre cuando el indicador en la forma AM ingresa a compartimientos intracelulares 53 donde es desesterificado y se puede unir a iones emitiendo fluorescencia permanentemente (Hu, Yu & Yu, 2005). Li, Sul & Haydon en 2003 reportaron que en astrocitos corticales de ratones cargados con Mag-Fluo-4, AM por 45 min a 37 °C el indicador tenía preferencia por compartimientos intracelulares, especialmente el RS. Olivera & Pizarro en 2018 emplearon el indicador Mag-Fluo-4, AM para registrar el cambio en las concentraciones de Ca2+ a nivel de RS cargando las células por 1 h con el indicador, reportaron que si utilizaban periodos de carga más cortos (30 min) las células mostraban una señal proveniente del citoplasma y no del RS. Calderón et al. en 2013 reportaron en células de FDB cargadas entre 8 y 10 µM del indicador Mag-Fluo-4, AM por 40 min a 21-22 °C una compartimentalización menor al 10 %. Nosotros obtuvimos un porcentaje de compartimentalización menor en nuestros experimentos (1,1±0,7 %), probablemente por la reducción que hicimos de la concentración y tiempo de carga del indicador, así como la baja temperatura a la que cargamos (ambiente, típicamente 23-25 °C). Determinación de la Kd Se conoce que la Kd de la mayoría de los indicadores de Ca2+ in vitro es menor a la Kd in situ. Esto se debe a que en la célula la Kd se ve influenciada por variables ambientales como la fuerza iónica, la temperatura, el pH, la presión, la viscosidad o presencia de otros sitios de unión como proteínas de unión a Ca2+ o cationes divalentes tales como Mg2+ (Hu, Yu & Yu, 2005; Friedrich & Head en 2017). Por lo tanto la Kd también puede variar entre un tipo de célula y otra. 54 El fabricante reporta en el catálogo del indicador Mag-Fluo-4 una Kd de 22 μM in vitro a 22 °C, Hollingworth, Gee & Baylor, 2009 reportaron una Kd de 70 μM in vitro a 21 °C, Calderón et al. en 2013 reportaron una kd in vitro de 21,6 μM, 27,8 μM y 29,1 μM en presencia de 0, 1 y 2 mM de Mg2+ libre, respectivamente, a 20 °C. Olivera & Pizarro en 2018 estimaron una Kd in vitro de 90 μM. Nuestra Kd determinada in situ (118,9 μM) fue mayor que todos los datos anteriormente reportados in vitro para Mag-Fluo-4, como era esperado por la presencia de proteínas dentro las células musculares. Comparaciones de las Kd determinadas in vitro e in situ para otros indicadores han demostrado diferencias hasta cinco veces más alta en los valores determinados in situ (Hu, Yu & Yu, 2005), observación que concuerda con nuestros resultados, lo que resalta la importancia de determinar la Kd directamente en la célula de estudio. Se recomienda usar al menos 6 puntos para construir la curva de calibración (Friedrich & Head en 2017), nosotros utilizamos 9 puntos incluyendo la Fmin y la Fmáx. Consideramos que cada punto debe de tener al menos 5 réplicas, este número no se logró en los experimentos de 4 μM, 40 μM y 100 μM de Ca2+ libre por agotamiento de la solución calibradora, pero ya tenemos previsto completar el número de experimentos. Se incluirán otras concentraciones intermedias. Esperamos que esto mejore la dispersión de los valores de los datos de la curva y el ajuste, lo que probablemente cambiará el x0 (Kd). 55 Determinación de la Fmáx La Fmáx es un parámetro que se debe determinar in situ, calcularlo in vitro causará inconsistencias entre la fluorescencia experimental, la Fmin, la Fmáx y la Kd, ocasionando una estimación incorrecta de la concentración de Ca2+ (Hu, Yu & Yu, 2005). En indicaciones para determinar in situ la Fmáx de indicadores fluorescentes de Ca2+ recomiendan los ionóforos como Ionocimina y A23187 (Hu, Yu & Yu, 2005; Friedrich & Head en 2017). Westerblad & Allen, en 1991 utilizaron 10 µM de Ionomicina en células de FDB de ratón, Petr & Wurster, en 1997 trabajaron con 10 µM de Ionomicina en la línea celular de astrocitos U373MG, Ljubojevic et al. en 2011 usaron A23187 en cardiomiocitos de ratón y Cully et al. en 2016 emplearon 50 µM de Ionomicina en células de EDL de ratas. En nuestros experimentos empleamos Ionomicina y Saponina. La Saponina es un agente conocido por interactuar con las moléculas de colesterol de la membrana celular causando perforaciones, además se ha reportado que en mamíferos la Saponina reduce la capacidad del RS para acumular Ca2+ (Launikonis & Stephenson, 1997), propiedad que ayudaría, junto con el CPA a evitar la amortiguación del Ca2+ a través del RS en la determinación de los diferentes parámetros necesarios para la calibración in situ. La Saponina se ha empleado para permeabilizar membranas celulares de músculo esquelético de rana (Caputo & Bolaños, 1994), cardiomiocitos de rata (Lukyanenko & Gyorke, 1999), células acinares parotídeas (Tojyo, Tanimura & 56 Matsumoto, 1997) y células de FDB de ratón (Calderón et al. 2013). Al comparar los resultados de la Fmáx obtenidos con Ionomicina (102±27,402 U.A.) y Saponina (150,889±8,798 U.A) encontramos que, bajo las mismas condiciones, permeabilizar la célula con Ionomicina subestima la Fmáx del indicador en un 32,4 %, lo que ocasiona una sobreestimación de la concentración de Ca2+. Por ejemplo, cuando determinamos el pico de concentración de Ca2+ libre citoplasmático alcanzado después de un estímulo eléctrico (n=14) con la Fmáx determinada con Saponina, encontramos una concentración de Ca2+ libre de 17,37±4,1 μM, pero si en la fórmula utilizamos la Fmáx obtenida con Ionomicina, encontramos una concentración de Ca2+ libre de 27,76±7,09 μM, lo que representa una diferencia en la concentración de Ca2+ del 59,8 %. De nuestros resultados se deduce que algunas concentraciones de Ca2+ intracelular publicadas por otros grupos Westerblad & Allen, 1991; Petr & Wurster, 1997; Cully et al. 2016) que utilizaron Ionomicina en sus calibraciones podrían estar sobreestimadas. Posiblemente esta diferencia se deba a que la permeabilización de la membrana ejercida por la Ionomicina no es suficiente para que ingrese el Ca2+ a la célula hasta alcanzar una concentración que sature al indicador, otra posible explicación es que con Ionomicina al ser más lento el ingreso de Ca2+, en la célula se pueden activar mecanismos de remoción Ca2+ citoplasmático, también podría pensarse que al permeabilizar con Saponina la célula, el indicador se sale menos antes de alcanzar una concentración saturante Ca2+ por lo que presentaría una mayor señal del indicador. Observamos que la acción de la Saponina y la Ionomicina junto con una alta concentración de Ca2+, producen un acortamiento considerable de la 57 célula como respuesta al estímulo, por lo tanto, no consideramos que esta sea la explicación a las diferencias encontradas. Calderón et al. en 2013 en células de FDB de ratón cargadas entre 8 y 10 µM con el indicador Mag-Fluo-4 por 40 min a una temperatura de 21-22 °C, determinaron una Fmáx del indicador de 160±14 U.A. permeabilizando la membrana celular con Saponina + 50 mM de Ca2+. La Fmáx determinada en nuestros experimentos (150,889±8,798 U.A) está acorde con estos resultados. Calibración de los transitorios de fluorescencia en términos de concentración de Ca2+ Muchos indicadores fluorescentes de Ca2+ tienen sensibilidad al Mg2+, el indicador Mag-Fluo-4 parece presentar una desventaja mayor con respecto a otros indicadores en este aspecto al tener una Kd in vitro reportada por el fabricante de 4,7 mM. Se ha reportado que esto genera problemas principalmente en la Fbasal, dado que, gran parte de esta fluorescencia se deriva del indicador unido a Mg2+ y no al Ca2+, tal y como lo calculamos arriba, y como había sido sugerido previamente (Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Baylor & Hollingworth, 2011). Williams et al. en 1990 determinaron una concentración de Ca2+ basal de 124 nM en células de FDB en ratones, Shannon & Bers, en 1997 reportaron una concentración de Ca2+ basal de 100 nM en cardiomiocitos de rata y Cully et al. en 2016 obtuvieron una concentración de Ca2+ basal en el orden de 100 nM en células de EDL de rata, concentraciones que son marcadamente inferiores al valor 58 de la concentración basal de Ca2+ (8,7±0,4 μM) determinado en esta investigación sin realizar la corrección matemática. La gran diferencia entre nuestros valores y los reportados puede derivar de que nuestra Fbasal está altamente contaminada con Mg2+, por las siguientes razones: i) Se ha reportado en la literatura (Hollingworth, Gee & Baylor, 2009 y Baylor & Hollingworth en 2011) que la Fbasal de algunos indicadores, incluido el Mag-Fluo-4, está altamente influenciada por el Mg2+. ii) Resultados de Calderón et al, 2013, muestran que al cargar las células con 100 μM de BAPTA-AM (un quelante de Ca2+ y no de Mg2+) (Fig. 15A) la Fbasal emitida por el indicador Mag-Fluo-4 no se altera, por el contrario si las células se cargan con 200 μM EDTA-AM (un quelante de Ca2+ y Mg2+) (Fig. 15B) la Fbasal emitida por el indicador Mag-Fluo-4 se reduce en un 34,3±3,4 %. iii) Creemos que el decaimiento en la señal observado cuando estimulamos las células con las soluciones calibradoras de Ca2+ libre con 1 μM, 4 μM o 40 μM, las cuales no contenían Mg2+, es producto de la dilución del Mg2+ en el medio. La reducción en el 22,47 % en la señal de la Fbasal evidenciada en nuestros experimentos está acorde con la reducción en la señal en el 34,3±3,4 % observada por Calderón et al. cuando cargaron las células con 200 μM EDTA-AM. iv) Al realizar una corrección matemática obtuvimos una concentración de Ca2+ basal de 171±0,008 nM, este valor es más cercano a los datos reportados en la literatura ya mencionados. 59 Figura 15. Efecto de cargar las células con quelantes de Ca2+ o Mg2+. (A) No se observó ningún efecto sobre la Fbasal cuando las células se cargaron con 100 μM de BAPTA-AM (n=13). En cambio, como se muestra en un registro representativo (B), hubo una reducción de 34,3±3,4 % de la Fbasal cuando las células se cargaron con 200 μM EDTA-AM (n=7). Esto sugiere que la Fbasal depende principalmente del Mg2+ libre intracelular. Cortesía de Calderón et al. 2013. Hollingworth, Zhao & Baylor en 1996 reportaron tras una sacudida simple un pico de Ca2+ de 17,8±0,4 μM en células de EDL de ratones BALC/c cargadas con Mag- Fura-2. Caputo, Bolaños & González, en 2004, asumieron que la Kd del indicador Mag-Fluo-4 in situ era el doble que in vitro y determinaron un pico de Ca2+ de 24 μM en células de FDB en ratones NMRI. Nosotros encontramos un pico promedio en la concentración de Ca2+ libre tras una sacudida simple de 17,37±4,1 µM (n=14), valor que concuerda con los resultados anteriormente mencionados. Es importante mencionar que el Mag-Fura-2 y el Mag-Fluo-4 tienen afinidad por el Mg2+, por lo tanto, es importante determinar en futuras investigaciones que 0 20 40 60 80 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 F ba sa l N or m al iz ad a Tiempo (min) 20 40 60 80 100 120 140 160 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 F ba sa l N or m al iz ad a Tiempo (min) Tyrode BAPTA-AM 100 μM Tyrode EDTA-AM 200 μM Tyrode Tyrode EDTA-AM 400 μM 60 influencia puede tener la concentración de Mg2+ libre en el pico máximo de la señal del indicador tras una sacudida simple, aunque la literatura sugiere que durante una sola contracción el Mg2+ presenta poca contribución en los cambios en la señal del indicador Mag-Fluo-4 (Konishi et al. 1991, Hollingworth, Gee & Baylor, 2009; Calderón, Bolaños & Caputo, 2010a). Consideraciones finales Las señales obtenidas en la determinación de los parámetros para la calibración del indicador presentan en general cambios grandes en cortos periodos de tiempo. Consideramos que el uso del fotomultiplicador es una buena metodología para adquirir las señales, pues al permitir grabar los cambios de la señal en el tiempo podemos posteriormente procesar el registro y determinar con precisión la señal en los puntos de interés. También es posible registrar las señales en video a través de una cámara acoplada al microscopio y posteriormente seleccionar la imagen en el tiempo, lo cual requiere de una cámara con alta velocidad y registros de mayor tamaño. Realizar el registro por medio de imágenes fotográficas y determinar posteriormente la DIC, es un proceso que depende del momento en el que el investigador considere el indicado para capturar la imagen. Por la rapidez de la señal muy posiblemente no se logre capturar con precisión el punto de interés, causando errores graves en la determinación de los parámetros. Además, el análisis de imágenes de fluorescencia toma más tiempo que el análisis de los registros derivados del fotomultiplicador. 61 Es necesario completar el número de experimentos para determinar la Kd, creemos que esto mejorará el ajuste de la curva y nos dará una Kd in situ del indicador Mag-Fluo-4 más precisa. Hu, Yu & Yu en 2005 recomiendan que para un análisis cuantitativo del cambio en las concentraciones de Ca2+ libre citoplasmático se debe tener en cuenta la fluorescencia de fondo después de la carga, pues la célula a través de transportadores puede liberar al espacio extracelular indicador desesterificado, que se puede unir a los iones presentes en el medio y sobreestimar la señal intracelular. Debemos determinar bajo nuestras condiciones estandarizadas la fluorescencia de fondo del indicador Mag-Fluo-4 después de la carga. Consideramos que se debe analizar con mayor profundidad la interferencia del Mg2+ en la señal del indicador Mag-Fluo-4 para discutir, según sus ventajas y desventajas, la utilidad de este indicador en el registro de señales provenientes del cambio en las concentraciones de Ca2+ libre citoplasmático en células musculares intactas. Una calibración adecuada del Mag-Fluo-4 tiene implicaciones en la precisión de los modelos matemáticos que se pueden construir para simular las señales obtenidas con este indicador. Por ejemplo, las constantes τon y τoff de la tasa de liberación de Ca2+ dependen del pico de Ca2+ que se obtenga para los transitorios de fluorescencia registrados con Mag-Fluo-4. De la misma manera, la magnitud de la liberación afecta la tasa de remoción que se debe incluir en el modelo para que el ajuste matemático sobre la señal experimental sea adecuado. 62 Conclusión Los parámetros para la calibración de un indicador fluorescente varían considerablemente según la metodología empleada para determinarlos, la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la viscosidad, la unión a proteínas, la presencia de otros iones (especialmente el Mg2+), el instrumento de medición utilizado y su configuración, la concentración del indicador y el tipo de célula. Estimar con precisión la concentración de Ca2+ libre citosólico en células musculares intactas mediante el indicador Mag-Fluo-4 solo será posible si se considera la contribución de cada uno de posibles artefactos que pueden alterar la señal del indicador y la medición de los parámetros necesarios para la calibración. Bajo nuestras condiciones estandarizadas de investigación establecimos que las células tipo IIX de FDB tiene una autofluorescencia de 0,046±0,013 U.A y el indicador Mag-Fluo-4 tiene in situ una Fmin corregida de 0,14±0,097 U.A., una compartimentalización del 1,1±0,7 %, una Kd de 118,9 μM y una Fmáx corregida de 150,889±8,798 U.A.. Utilizando en conjunto estos resultados y realizando un ajuste matemático logramos establecer que los transitorios de fluorescencia de Ca2+ de células tipo IIX de FDB tienen una concentración de Ca2+ basal de 171±0,008 nM y un pico en la concentración de Ca2+ libre citoplasmático de 17,37±4,10 µM tras una sacudida simple. Para realizar una estimación más precisa de las concentraciones de Ca2+ libre citoplasmático creemos importante aumentar el número de algunos experimentos, considerar las posibles interferencias en la señal ocasionadas por el Mg2+ libre y 63 establecer la fluorescencia de fondo producto de la fuga del indicador intracelular desesterificado. Hasta donde conocemos esta es la primera investigación centrada en determinar las propiedades in situ del indicador Mag-Fluo-4 en células musculares intactas. 64 Agradecimientos Quiero agradecer a mi tutor el doctor Juan Camilo Calderón Vélez por la constate asesoría, el tiempo invertido y la confianza en mi trabajo. Al profesor Jaime Alberto Pérez Giraldo, Jefe del Departamento de Fisiología y Bioquímica de la Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, por el apoyo y por creer en la investigación en el área de Fisiología y Bioquímica. A Óscar Andrés Rincón Cardeño por la contribución en los cálculos de la fracción de indicador unido a Ca2+ y Mg2+ y a Leidy Bibiana Arango Álzate por el apoyo en los experimentos. Al Grupo de Investigación en Fisiología y Bioquímica-PHYSIS de la Universidad de Antioquia. Al CODI y a la Oficina de Desarrollo Institucional de la Universidad de Antioquia por el financiamiento del proyecto. Declaración de conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés. Financiación Convocatoria Programática Ciencias Exactas 2016. Proyecto CODI 2015-7858 65 Bibliografía • Ackermann, M. A., Ziman, A. P., Strong, J., Zhang, Y., Hartford, A. K., Ward, C. W., ... & Bloch, R. J. (2011). Integrity of the network sarcoplasmic reticulum in skeletal muscle requires small ankyrin 1. J Cell Sci, 124(21), 3619-3630. • Andrade, F. H., Reid, M. B., & Westerblad, H. (2001). Contractile response of skeletal muscle to low peroxide concentrations: myofibrillar calcium sensitivity as a likely target for redox - modulation. The FASEB journal, 15(2), 309-311. • Bar, A. & Pette, D. (1988). Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters, 235(1-2), 153-155. • Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., & Peter, J. B. (1971). Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. 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