Generación y caracterización de cultivos 2D y 3D para el estudio de la EAF (PSEN1 E280A) y su aplicación en el diseño de terapias alternativas

Abstract

RESUMEN: La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo de mayor prevalencia en el mundo. Se caracteriza clínicamente por pérdida progresiva de la memoria y alteraciones cognitivas y neuropatológicamente, por la presencia de placas seniles, ovillos neurofibrilares y pérdida neuronal. Dentro de las causas genéticas de la enfermedad se ha identificado la mutación en el gen PRESENILINA 1 (PSEN1) que resulta en el cambio de un ácido glutámico por una alanina en la posición 280 de la proteína (E280A), dando origen a la EA familiar (EAF) en Antioquia. La EAF está asociada con la presentación de marcadores histopatológicos como las placas seniles, las cuales están compuestas por el péptido β-amiloide de 42 aminoácidos (βA42) en la región cortical del cerebro, ovillos neurofibrilares intracelulares compuestos por la proteína Tau hiperfosforilada, pérdida progresiva de neuronas colinérgicas del hipocampo y la gliosis o activación de la glia. Todos estos hallazgos neuropatológicos involucran el fenómeno de estrés oxidativo (EO), que finalmente conduce a la muerte neuronal. Hasta el presente, no existe un modelo que reproduzca el espectro completo de la neuropatología de la EAF con la mutación E280A en la PSEN1 de forma natural. Adicionalmente, no existe ningún tratamiento terapéutico eficaz o definitivo destinado a reducir o retardar la presentación clínica de la EAF. En este sentido, durante los últimos años, se ha postulado el potencial efecto neuroprotector de algunas moléculas naturales y/o sintéticas, como los cannabinoides (v. gr. CP55940), la Epigalocatequina-3-galato (EGCG) y la melatonina. Sin embargo, su efecto neuroprotector no se ha estudiado aún en modelos in vitro específicos de la EAF PSEN1 E280A. Por lo tanto, en la presente tesis nos propusimos establecer y analizar dos modelos de estudio de la EAF; un modelo planar de cultivos 2D y uno tridimensional 3D de la EAF (PSEN1 E280A) a partir de Células mesenquimales estromales (CME) -provenientes de donantes voluntarios- a las que se les tamizó en búsqueda de la mutación (PSEN1 E280A); lo que nos permitiría la recapitulación neuropatológica de la enfermedad y la evaluación del efecto neuroprotector de moléculas como el cannabinoide CP55940, la EGCG y la melatonina. En este contexto, las CME silvestres (PSEN1 WT) y con la mutación (PSEN1 E280A) fueron aisladas de cordón umbilical y sangre menstrual, caracterizadas y transdiferenciadas a neuronas colinérgicas (NCL) y esferoides cerebrales (EC). Una vez obtenidos los cultivos 2D de NCL PSEN1 WT y PSEN1 E280A, se evaluaron los marcadores neuropatológicos de EO y de apoptosis (v.gr. sAPPβfi /βA42e, Tau-P/Tau-T y DJ-1Ox) en presencia o ausencia de CP55940 y la EGCG y posteriormente, se evaluaron marcadores de EO y muerte celular. De igual manera, en el modelo 3D, los EC PSEN1 WT y PSEN1 E280A fueron cultivados en presencia o ausencia de EGCG y melatonina, después de lo cual se evaluaron marcadores de EO y muerte celular.

Como resultados de este trabajo, se logró el aislamiento de las CME de la gelatina de Wharton y sangre menstrual, la caracterización del fenotipo, diferenciación y transdiferenciación a NCL en 2D y 3D de las CME PSEN1 WT y PSEN1 E280A. Así mismo, se demostró, en ambos modelos, la recapitulación de la neuropatología de la EAF PSEN1 E280A con el aumento del sAPPβf/βA42 endógeno y la fosforilación de Tau en las células PSEN1 E280A, comparadas con las silvestres. Además, se evidenció que las células PSEN1 E280A poseen niveles altos de EO y de marcadores de muerte (v.gr. p53, c-JUN, PUMA y CASPASA3), junto con pérdida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y fragmentación del ADN. Igualmente, los cultivos 2D y 3D mutados mostraron una desregulación del flujo de Ca2+ y una actividad deficiente de acetilcolinesterasa (AChE) en comparación con los WT. Destacándose en el modelo 3D la activación en un menor tiempo -y mucho más notoria- de los marcadores neuropatológicos de la EAF en tan solo 11 días. Se evidenció que el CP55940, la EGCG y la melatonina disminuyen el EO, los niveles de expresión del sAPPβf/βA42 y restituye el ΔΨm, y regula el flujo de Ca2+ en las células PSEN1 E280A. Estos resultados contribuyen, por primera vez con: 1) el establecimiento y validación de modelos preclínicos 2D y 3D derivados de CME con la mutación E280A PSEN1 para el estudio de la fisiopatología de la EAF 2) la validación del uso de estos modelos en el diseño de terapias alternativas en la EAF, con lo que adicionalmente, en estos modelos se evaluó y evidenció el potencial efecto neuroprotector de CP55940, EGCG y melatonina como antioxidantes y anti-amiloidogénicos reduciendo los niveles de los marcadores neuropatológicos, de EO y de muerte en este modelo pre-clínico de la EAF en Antioquia.

Palabras clave: Células Mesenquimales Estromales, Enfermedad de Alzheimer Familiar, polifenoles, cannabinoides, melatonina, mutación E280A, Estrés oxidativo, cultivos 2D, esferoides cerebrales, organoides.

ABSTRACT: Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder in the world. It is characterized clinically by progressive memory loss and cognitive alterations and neuropathologically, by the presence of senile plaques, neurofibrillary tangles and neuronal loss. Within the genetic causes of the disease has been identified the mutation in the gene PRESENILIN 1 (PSEN1) that results in the change of a glutamic acid by an alanine at position 280 of the protein (E280A) and gives rise to familial AD (FAD) in Antioquia. FAD is associated with the presentation of histopathological markers such as senile plaques, which are composed of the 42-amino acid peptide, β-amyloid (βA42) in the cortical region of the brain, intracellular neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated Tau protein, progressive loss of cholinergic neurons of the hippocampus and gliosis or glia activation. All of these neuropathological findings involve the phenomenon of oxidative stress (OS), which ultimately leads to neuronal death. To date, there is no model that replicates the full spectrum of FAD neuropathology with the E280A mutation in PSEN1 naturally. Additionally, there is no effective or definitive therapeutic treatment aimed at reducing or delaying the clinical presentation of FAD. In this sense, in recent years, the potential neuroprotective effect of some natural and/or synthetic molecules, such as cannabinoids (e.g., CP55940), Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and melatonin, has been postulated. However, its neuroprotective effect has not yet been studied in specific in vitro models of PSEN1 E280A FAD. Therefore, in this thesis we proposed to establish and analyze two models of study for the FAD, a planar model of 2D cultures and one three-dimensional (3D) (PSEN1 E280A) from mesenchymal stromal cells (MSC) -from voluntary donors- who had been tested for the mutation (PSEN1 E280A); that would allow us to recapitulate the neuropathological disease and evaluate the neuroprotective effect of molecules such as the cannabinoid CP55940, EGCG and melatonin. In this context, wild (PSEN1 WT) and mutated (PSEN1 E280A) MSC were isolated from umbilical cord and menstrual blood, characterized and transdifferentiated to cholinergic neurons (CLN) and cerebral spheroids (CS). Once the 2D cultures of WT and PSEN1 E280A CLN were obtained, the neuropathological markers of OS and apoptosis (v.gr. sAPPβfi /βA42e, TAU-P/TAU-T and Ox DJ-1) were evaluated in the presence or absence of CP55940 and EGCG and subsequently, markers of EO and cell death were evaluated. Similarly, in the 3D model, WT and PSEN1 E280A CS were cultured in the presence or absence of EGCG and melatonin, after which markers of OS and cell death were evaluated.

As a result of this work, the isolation of the MSC from Wharton's jelly and menstrual blood was achieved, the characterization of the phenotype, differentiation and trans-differentiation to CLN (2D) and CS (3D) of the WT and PSEN1 E280A MSC. Likewise, it was demonstrated, in this model, the recapitulation of the neuropathology of the PSEN1 E280A FAD with the increase of endogenous sAPPβf/ βA42 and the phosphorylation of TAU in PSEN1 E280A cells, compared to WT ones. In addition, it was shown that PSEN1 E280A cells have high levels of OS and death markers (v.gr. p53, c-JUN, PUMA and CASPASE3), along with loss of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and DNA fragmentation. Similarly, mutated 2D and 3D cultures showed dysregulation of Ca2+ flow and deficient acetylcholinesterase (AChE) activity compared to WT. Remarking in the 3D model the activation of FAD neuropathological markers in a shorter time -and more notably-. It was evidenced that CP55940, EGCG and melatonin decrease OS, sAPPβf/βA42 expression levels and restore ΔΨm, and regulate the flow of Ca2+ in PSEN1 E280A cells. These results contribute, for the first time, to 1) the establishment and the validation of a preclinical model of 2D and 3D neuronal models derived from CME with the E280A PSEN1 mutation for the study of the pathophysiology of FAD and 2) the validation of the use of this model in the design of alternative therapies for FAD, additionally, this model evaluated and evidenced the potential neuroprotective effect of CP55940, EGCG and melatonin as antioxidants and anti-amyloidogenic reducing the levels of neuropathological markers, OS and death in this pre-clinical model of FAD in Antioquia.

Keywords: Mesenchymal Stromal Cells, Familial Alzheimer's Disease, polyphenols, cannabinoids, melatonin, E280A mutation, Oxidative stress, 2D cultures, brain spheroids, organoids