Evaluación de proteínas aisladas de fuentes vegetales como agentes encapsulantes del extracto de semillas de annatto

Abstract

INTRODUCCIÓN: Las moléculas bioactivas presentes en las semillas de annatto (Bixa orellana L.) han sido altamente estudiadas, entre otros motivos, por sus propiedades antimicrobiana y antioxidante de gran interés para las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética. Propiedades que han sido atribuidas principalmente a los compuestos polifenólicos y a la bixina como principal carotenoide. Al ser estos compuestos bioactivos más susceptibles a los procesos de degradación que sus homólogos sintéticos en las condiciones de procesamiento, almacenamiento y en los procesos de digestión; debido a los cambios de temperatura, exposición a la luz, de oxígeno y cambios de pHs, los bioactivos de fuentes naturales han sido cuestionados para su uso a nivel industrial. Para potencializar el uso de estos compuestos naturales, los procesos de encapsulación se presentan como una alternativa de protección de estos compuestos contra las circunstancias destructivas, mejorando su biodisponibilidad. En este sentido, la gelación iónica cobra importancia como mecanismos de encapsulación de activos debido que para la formación de hidrogeles no es necesaria la aplicación de altas temperaturas ni el uso de solventes, siendo el alginato de sodio el sistema más empleado como material de recubrimiento. Sin embargo, los hidrogeles basados en proteínas vegetales son especialmente acogidos por diferentes sectores debido a propiedades como: alto valor nutricional, excelentes propiedades funcionales, naturaleza anfifílica, biocompatibilidad, biodegradabilidad y menor toxicidad en comparación con los polímeros sintéticos. OBJETIVO: “evaluar las proteínas aisladas de fuentes vegetales (quinua, lentejas y fríjol negro) como material de recubrimiento en la encapsulación del extracto de annatto por gelación iónica y estudiar el efecto de sus modificaciones estructurales en la capacidad encapsulante de las proteínas“. METODOLOGÍA: la obtención del extracto de semillas annatto fue optimizado y caracterizado por los métodos de extracción asistida por ultrasonido (UAE) y microondas (MAE) aplicando un diseño experimental (DOE) de superficies de respuestas para cada proceso con cuatro factores: pH del sistema de extracción (2-11), concentración de solvente (50-96%), relación semilla-solvente (1:2–1:10) y tiempo de tratamiento de ultrasonido (UAE: 0-30 min) o microondas (MAE: 0- 5 min). Las variables respuesta de cada proceso de obtención del extracto fueron: concentraciones de fenoles totales y bixina en el extracto. La actividad antimicrobiana, contra Bacillus cereus y Staphylococcus aureus, y la actividad antioxidante fue determinada a los extractos obtenidos en los procesos optimizados. Por otro lado, la extracción de las proteínas vegetales de las semillas de quinua (Chenopodium quinoa Willd), fríjol negro (Phaseolus vulgaris) y lentejas (Lens culinaris) fueron optimizadas utilizando un DOE para cada fuente con el fin de obtener el máximo rendimiento de extracción de las proteínas evaluando el efecto de los factores: pH (6-10), relación buffer : material vegetal (5:1 - 15:1) y tiempo de ultrasonido (0-20 min); adicionalmente, fue evaluado el efecto de este último factor sobre las propiedades funcionales de las proteínas: absorción de agua y aceite (WHC y FAC), temperatura de gelación (Tgel), rendimientos de extracción (EY), actividad y estabilidad emulsionante (EAI y ESI), cantidad de grupos SH (SH), punto isoeléctrico (PI) y peso molecular (MW) de las proteínas obtenidas. Una vez optimizados los procesos de extracción de las proteínas, se procedió a estandarizar el proceso de encapsulación por gelación iónica empleando las proteínas extraídas por la metodología optimizadas como material de recubrimiento, para lo cual se emplearón pruebas reológicas que determinaron las mejores condiciones que se adaptaran al mecanismo de encapsulación por gelación iónica. El tiempo de tratamiento térmico a 80°C (10-120 min), pH de la solución (8-11), concentración de proteína (2.5-10.0%) y el cloruro de calcio (0-10%) se tomaron como variables para evaluar la capacidad de formación de cápsulas vacías por el procesos de encapsulación por gelación iónica. Posteriormente, los aislados proteicos que presentaron la capacidad de formación de cápsulas por gelación iónica fueron modificadas estructuralmente por hidrólisis enzimática (Alcalasa 2.4L por 15 y 60 min), N-acilación (cloruro de dodecanoilo) y N-cationización (cloruro de glicidiltrimetilamonio) para evaluar los efectos de las modificaciones en las propiedades funcionales de las proteínas y la eficiencia de encapsulación del extracto de annatto y un colorante como modelo de un sistema totalmente hidrofílico. Finalmente, una vez analizadas y definidas las proteínas que presenten la mayor eficiencia de encapsulación del extracto de annatto por el método de gelación iónica, estas capsulas fueron caracterizadas para el tamaño de partícula, espectroscopía de transmisión infrarroja, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido. La estabilidad térmica en almacenamiento de las actividades antioxidantes y antimicrobianas, el contenido de los compuestos polifenólicos y el contenido de bixina del extracto libre y encapsulado se evaluaron durante 12 días a 4°C, 25°C y 65°C. RESULTADOS: Las condiciones óptimas para la extracción de los compuestos bioactivos del extracto de semillas de annatto por UAE fueron: pH de 7.0, relación de semilla : solvente de 1:7 y tiempo de tratamiento de ultrasonido de 20min, obteniéndose un extracto con 0.62% de bixina, 3.81mg ácido gálico/mg equivalente de compuestos polifenólicos, capacidad antioxidante por ABTS, FRAP y DPPH de 1035.7, 424.7 y 1161.5 µMtrolox/L, respectivamente y una concentración mínima inhibitoria contra Bacillus cereus y Staphylococcus aureus de 32 y 16 mg/L, respectivamente. Para el caso de MAE, se obtuvieron los siguientes resultados: 0.57% de Bix, 4.36mgAG/mg semilla para Ft, ABTS 577,68µMTrolox/L, FRAP 316,37µMTrolox/L, DPPH 1043,90µMTrolox/L y CMIs contra B. cereus y S. aureus de 16 y 8ppm, respectivamente. Los resultados demostraron que no hay diferencias estadísticas entre los métodos UAE y MAE (p > 0,05), pero si hay diferencias con la extracción por lixiviación, demostrando que las UAE y MAE son más eficientes debido a que requieren menos tiempo de extracción para obtener los compuestos polifenólicos y la bixina de las semillas de annatto. Consecuentemente, la actividad antimicrobiana y antioxidante de los extractos obtenidos por ambas tecnologías emergentes fueron mayores que los reportados por los extractos obtenidos por lixiviación, lo que demuestra que ambos métodos no afectan las propiedades bioactivas del extracto. Por otro lado, los niveles de los factores que maximizaron el rendimiento de extracción de las proteínas de la quinua y de fríjol negro fueron: pH de 9, relación buffer-material vegetal de 5:1 y tiempo de ultrasonido de 20min, mientras que, para la lenteja fue necesaria una relación de buffer-material vegetal 1:10 al mismo pH y tiempo de ultrasonido optimizado para las otras fuentes. La aplicación de ultrasonido generó un efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) para propiedades funcionales relacionadas con la estructura secundaria de las proteínas como Tgel, EAI, WHC y FAC; sin embargo, la aplicación de ultrasonido en el procesos de extracción no género un efecto estadísticamente significativo (p > 0,05) para las propiedades de las proteínas relacionadas a su estructura primaria. El análisis de componentes principales (PCA) mostró tres grupos independientes, el primero relaciona SH con Tgel, el segundo relaciona el tratamiento de extracción con EY y el último MW con EAI y FAC. Los resultados de la evaluación de los factores que influyen en el proceso de encapsulación por gelación iónica demostraron que la incorporación de Ca2+, el aumento en la concentración de proteína y la disminución del pH aumentaron el comportamiento elástico de las soluciones, independientemente de la fuente de proteína. Sin embargo, el tratamiento térmico y la concentración de la proteína en la solución causaron el mayor impacto en el comportamiento reológico de las proteínas y formación de geles, independientemente de la fuente, el pH o los iones Ca2+. A pesar de que las proteínas aisladas de fríjol negro presentaron la capacidad de formación de gel por tratamiento térmico en las pruebas reológicas, estas no presentaron la capacidad de formación de cápsulas por gelación iónica empleando la metodología estandarizada. La modificación de las proteínas vegetales por los métodos de hidrólisis enzimática, N-acilación y N-cationización favorecieron las propiedades funcionales de las proteínas como la solubilidad, la capacidad de adsorción de agua y de aceite, y la capacidad de formación y estabilidad de emulsiones. Sin embargo, la hidrólisis enzimática de las proteínas no favoreció la formación de geles y tampoco la capacidad de formación de cápsulas. Por su parte, las modificaciones estructurales generadas en las proteínas por N-acilación y N-cationización incrementaron la eficiencia de encapsulación tanto de compuestos hidrosolubles (colorante artificial) como del extracto de annatto en comparación con las obtenidas en las proteínas nativas, sin embargo, no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p ˃0,05). Por tal motivo, las proteínas de quinua y lentejas en su estado nativo fueron usadas para la evaluación de la estabilidad de los compuestos bioactivos del extracto de annatto encapsulado por gelación iónica. Finalmente, los resultados demostraron la capacidad de las proteínas nativas para encapsular el extracto de annatto con eficiencias de encapsulación que van del 58% al 80%, donde la estructura de la proteína y el contenido de aminoácidos fueron los factores relevantes para obtener una alta eficiencia de encapsulación. Los extractos libres almacenados a 65°C durante 12 días experimentaron una degradación de ~ 59.95% y ~ 44.33% de bixina y compuestos polifenólicos, respectivamente. Por el contrario, los extractos encapsulados con las proteínas vegetales nativas reportaron degradaciones entre el ~ 34.00% a ~ 4.05% para compuestos polifenólicos y de ~ 20.0% para la bixina. CONCLUSIÓN: Las proteínas vegetales extraídas de las fuentes de quinua y lentejas en su estado nativo presentaron una capacidad potencial de encapsulación del extracto de annatto por gelificación iónica cumpliendo su función de protección y estabilización de los compuestos bioactivos.